GATA-4基因促進5-氮雜胞苷誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌分化.pdf

1、目的:全世界每年都有數(shù)以萬計的患者被診斷為“充血性心力衰竭(CHF)”[1],其中很大部分是由冠狀動脈粥樣硬化和心肌梗塞造成的,因此缺血性心臟病己成為危害人類健康的最主要疾病。人們普遍認為,成熟的心肌細胞是終末分化細胞,一旦損傷壞死后不能再生,心肌梗死(MI)后,即使通過一些臨床治療能夠改善心肌缺血的癥狀,卻不能逆轉心肌細胞的壞死,最終將導致充血性心力衰竭的發(fā)生。而成體心臟中的心肌干細胞數(shù)量極少,起不到修復的作用;加上心臟移植療法供體稀

2、缺、免疫源性高和費用昂貴的限制,因此,現(xiàn)在許多研究者把目光投向干細胞移植治療技術。大量研究表明,可以通過細胞移植術,使干細胞在瘢痕組織內(nèi)分化成為有功能的心肌細胞來替代壞死的心肌,進而改善心功能。但是關于細胞移植還存在許多難題,首先就是用于移植的干細胞向心肌細胞的分化效率低,達不到臨床移植所需的數(shù)量。因此研究干細胞向心肌細胞分化時的具體機制是極具意義的一項課題。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchyma

3、l Stem Cells,BMSCs)易于從自體獲取,回植后不會發(fā)生免疫排斥反應;在體外易進行分離、培養(yǎng)和擴增,并可長時間在體外保持未分化狀態(tài),具有多向分化潛能:其在特定的條件下可向肌腱細胞、骨細胞、軟骨細胞等方向分化,且體外易進行外源性基因加工,因此BMSCs是組織工程中較為理想的種子細胞。
　　 眾多學者認為,心肌分化的過程始于某個或某些關鍵基因的啟動,這些基因活化后的蛋白產(chǎn)物,即轉錄因子可以使下游相應的靶基因呈級聯(lián)式地激活

4、,直至分化完成。其中,GATA-4被認為和心臟發(fā)育尤為密切。它開始表達于心臟早期,參與心臟前體細胞的分化,房室分隔,心臟的環(huán)化,傳導系統(tǒng)的發(fā)育及成熟心臟正常功能的維持。研究表明,GATA-4可能是通過其鋅指結構與Nkx2-5、TBX5、dHAND和MEF2等心臟特異性的轉錄因子相互作用形成復合物,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用?；蛲ㄟ^調(diào)控包括心臟肌球蛋白重鏈-α(α-myosin heavy chain,α-MHC)、心肌鈣蛋白C(cardiac tro

5、ponin C,cTnC)、心房利鈉肽(atrial natriureticp eptide,ANP)和腦利鈉肽(brain natriureticp ep tide,BNP)等在內(nèi)的心臟結構基因的表達,發(fā)揮轉錄調(diào)控作用。GATA-4缺失或突變可引起心血管系統(tǒng)發(fā)育的異常。GATA-4能夠阻止藥物誘導的心肌細胞凋亡的發(fā)生并能夠降低藥物引起的心肌毒性,因此它對心肌細胞的正常存活也有一定的作用。
　　 細胞穿透肽(cell-penet

6、rating protein,CPP),是一種已被證實能夠通過蛋白質(zhì)轉導的方法穿透細胞膜到達細胞核,并且能夠保留其生物學活性的蛋白質(zhì)。在體內(nèi)及體外實驗中,CPP已成功地幫助蛋白質(zhì)、多肽、DNA和siRNA等大分子生物活性物質(zhì)傳遞到細胞內(nèi),VP22即為CPP中的一種。由于CPP不受細胞種類的限制,并且傳遞效率高,因此CPP常用于在不同組織間傳遞大分子量的生物活性蛋白。研究表明,CPP的作用機制可能為,CPP擁有強大的陽離子特性(這是CPP

7、必備的特征),使其對富含陰離子的細胞膜及核苷酸有強大的粘附作用,使其能夠穿透細胞膜并凝集在細胞核中。迄今為止,CPP是唯一一種成功地在細胞間傳遞嵌合蛋白質(zhì)的方法。由于脂質(zhì)體轉染法缺少靶向作用及低轉化率,我們嘗試借助VP22穿透肽的載體作用幫助GATA-4轉染至BMSCs中。
　　 因此,本研究擬借助細胞穿透肽VP22的載體作用,利用脂質(zhì)體轉染法將GATA-4基因瞬時轉染SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,觀察其在誘導劑5-氮雜胞苷(5-a

8、zacytidine,5-aza)的作用下向心肌分化的情況,并與單純經(jīng)5-aZa誘導后的BMSCs向心肌細胞分化的情況作比較,以試圖闡明心肌細胞分化過程中的一些規(guī)律,為干細胞能夠有效轉化為心肌細胞提供策略。
　　 方法:
　　 1 pVP22-GATA-4/myc-His真核表達質(zhì)粒的轉化、鑒定與擴增
　　 由美國Marc Penn博士惠贈的pVP22-GATA-4/myc-His質(zhì)粒,經(jīng)常規(guī)CaCl2法轉化至大

9、腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌,涂布于含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上,37℃倒置培養(yǎng)12～24 h;挑取單個克隆菌落,進行擴增。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并檢測濃度,再經(jīng)XbaI、EcoRI雙酶切鑒定。
　　 2 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外分離、純化和擴增
　　 利用貼壁培養(yǎng)的方法從SD大鼠脛骨和股骨骨髓中分離純化BMSCs。BMSCs培養(yǎng)于含有15％小牛血清濃度的L-DMEM完全培養(yǎng)基中,3d首次換液,以后3-4d換液一次

10、,待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底時傳代。取第三代BMSCs做后續(xù)試驗。
　　 3 pVP22-GATA-4/myc-His真核表達質(zhì)粒轉染BMSCs
　　 轉染之前通過預實驗確定合適的細胞接種密度,轉染最佳體系。本實驗采用陽離子轉染試劑Lipofectamine2000將質(zhì)粒GATA-4:VP22轉染BMSCs,于轉染后48h以免疫細胞化學、免疫印跡法檢測GATA-4:VP22融合蛋白在BMSCs中的表達。
　　 45-氮胞

11、苷誘導外源表達GATA-4的BMSCs向心肌分化
　　 本實驗分為轉染組、未轉染組和空質(zhì)粒組,轉染組為5-aza誘導的瞬時轉染GATA-4基因的BMSCs:未轉染組為5-aza誘導的單純培養(yǎng)的BMSCs;空質(zhì)粒組為瞬時轉染PcDNA3.1空質(zhì)粒的BMSCs。用10μmol/濃度的5-aza分別對轉染組和未轉染組的細胞誘導24h。在誘導后的21、28d收集細胞,以免疫細胞化學、免疫印跡法檢測GATA-4:VP22融合蛋白、GATA

12、-4蛋白、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)在BMSCs中的表達。
　　 5統(tǒng)計學分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用配對t檢驗的統(tǒng)計分析方法,檢驗水準取α=0.05,當P＜0.05時認為有顯著差異。
　　 結果:
　　 1成功篩選出pVP22-GATA-4/myc-His質(zhì)粒并進行擴增,酶切鑒定結果顯示:可獲得約7500bp(未經(jīng)酶切的質(zhì)粒)和1300bp(經(jīng)酶切后的目

13、的基因片段)兩條條帶,與質(zhì)粒構建圖一致。
　　 2原代培養(yǎng)中,細胞是以克隆集落的方式增殖。接種后可見圓形、折光性較強的BMSCs散在分布,其間夾雜大量血細胞。24h后,少量BMSCs開始貼壁,剛貼壁的BMSCs仍保持圓形。72h后,大多數(shù)細胞已貼壁,貼壁細胞伸展呈多角形。未貼壁的細胞通過多次換液被清除。3-4d可見小的集落形成,7-14d,相鄰集落匯合成片達80％以上,細胞基本形態(tài)大致分為三種:紡錘樣成纖維形、小圓形和多角形。傳

14、代后,細胞于2-4h開始貼壁,24h內(nèi)完全貼壁,形態(tài)與原代細胞相似,3-5d匯合成片。第3代以后,細胞形態(tài)開始呈比較均一的成纖維狀,細胞排列呈明顯的漩渦狀、輻射狀。
　　 3實驗確定,轉染細胞傳代密度:2×106/cm2;轉染的最佳體系:采用質(zhì)粒DNA(μ g)和轉染試劑Lipofectamine2000(μ1)1:2.5的比率轉染。48h后用免疫細胞化學、免疫印跡法檢測到轉染組GATA-4:VP22融合蛋白在BMSCs中有表達

15、,未轉染組和空質(zhì)粒組無陽性表達。
　　 4細胞培養(yǎng)21、28d后,轉染組與未轉染組用免疫細胞化學、免疫印跡法均可分別檢測到GATA-4蛋白、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)在BMSCs中的表達,且28d表達量比21d表達量高,兩個時間點相比有顯著性差異(P＜0.05)。轉染組與未轉染組相比,在21、28d兩個時間點,轉染組GATA-4、cTnT兩個基因的表達量均比未轉染組高。統(tǒng)計分析結果顯示:轉染組21d、28d時GATA-4和cTn

16、T的表達量均高于未轉染組,兩者相比有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)?？召|(zhì)粒組無陽性表達。
　　 5轉染組21d、28d的細胞經(jīng)免疫印跡法測定,仍可表達GATA-4:VP22,未轉染組和空質(zhì)粒組無表達。
　　 結論:
　　 1在5-aza誘導條件下,外源轉染表達GATA-4基因的BMSCs向心肌分化的情況優(yōu)于未轉染的BMSCs細胞,說明轉錄因子GATA-4可以促進BMSCs向心肌分化。
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