骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的研究.pdf

1、由于人們生活水平的提高，冠心病成為現(xiàn)代社會發(fā)病率和死亡率不斷上升的疾病，而急性心肌梗死是重要的死亡原因。心肌梗死后，心肌細(xì)胞壞死、凋亡造成心肌細(xì)胞數(shù)目減少，由于心肌細(xì)胞不能再生，只能由成纖維細(xì)胞填充，因此在心肌缺血發(fā)生后壞死的心肌由瘢痕組織取代，并逐步發(fā)生心室重構(gòu)導(dǎo)致心臟收縮功能下降和心力衰竭。目前心肌梗死后的治療手段主要包括藥物治療、介入治療和手術(shù)治療。藥物治療通過減少心肌氧耗，在一定程度上緩解了病人的癥狀。冠脈介入治療及心臟搭橋手術(shù)

2、治療只能恢復(fù)局部血液供應(yīng)，挽救梗死區(qū)內(nèi)存活的心肌細(xì)胞，延緩左室重構(gòu)，改善病人預(yù)后，但無法使已梗死的心肌細(xì)胞再生，沒能從根本上修復(fù)梗死區(qū)，因此仍有部分病人不可避免地發(fā)展為心功能不全甚至導(dǎo)致心源性死亡。 近年來發(fā)展的細(xì)胞移植技術(shù)為心肌梗死的治療提供了新的方向并受到了人們的廣泛關(guān)注。通過細(xì)胞心肌移植術(shù)增加有功能的心肌細(xì)胞數(shù)目，可能是心肌梗死后心衰治療的最有效方法之一。此外近年來提出的治療性血管新生也已發(fā)展成為治療缺血性疾病的新方法。骨

3、髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中不同于造血干細(xì)胞的一類細(xì)胞，它在體內(nèi)能夠自我更新，保持未分化狀態(tài)，在體外合適的培養(yǎng)條件下，易于擴增，具有向多種細(xì)胞類型分化的潛能。1999年，Makino等首次在體外成功地誘導(dǎo)MSCs定向分化為心肌細(xì)胞。同時MSCs具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞的理論基礎(chǔ)和實驗基礎(chǔ)。2004年，Oswald等人發(fā)現(xiàn)在體外MSCs與VEGF165和2％胎牛血清共培養(yǎng)可誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞

4、。這些實驗為MSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進行細(xì)胞移植治療缺血性心臟病提供了良好的實驗基礎(chǔ)。 Notch信號通路在脊椎動物和無脊椎動物中高度保守，它在決定細(xì)胞分化上起重要作用。它對正常心血管系統(tǒng)的發(fā)育有重要作用，Notch信號表達(dá)不足或過量都會造成動物因心血管異常而死亡。此外，Notch信號系統(tǒng)在血管再生方面也有重要作用。Notch信號通路在MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的過程中可能也起著重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗主要研究了大鼠MS

5、Cs體外向心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的可行性，并研究了Notch信號通路對大鼠MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的影響，以期為缺血性心臟病的細(xì)胞移植治療提供良好的種子細(xì)胞。 研究目的： 1.體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，研究大鼠骨髓MSCs的生物學(xué)特性。用5-氮胞苷（5-Azacytidine，5-aza）定向誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化，研究MSCs體外向心肌細(xì)胞分化的可行性。 2.定向誘導(dǎo)大鼠骨髓MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞

6、分化，研究MSCs體外向內(nèi)皮細(xì)胞分化的可行性。研究誘導(dǎo)前后細(xì)胞增殖能力、遷移能力和形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)能力的變化。 3.采用RT-PCR方法檢測大鼠骨髓MSCs上Notch信號受體和配體mRNA的表達(dá)情況，研究MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞上Notch信號受體和配體mRNA的表達(dá)變化。向誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞中導(dǎo)入VEGF165基因來促進細(xì)胞的增殖和遷移能力。檢測轉(zhuǎn)染VEGF165基因前后細(xì)胞上Notch信號受體和配體mRNA的表達(dá)變

7、化，檢測細(xì)胞增殖能力、遷移能力和形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)能力的變化，研究Notch信號對誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)能力的影響，以期更好的誘導(dǎo)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力，為缺血性心臟病的細(xì)胞移植治療提供良好的種子細(xì)胞。 方法： 1.采用密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞分離培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓單個核細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，采用流式細(xì)胞儀檢測法鑒定

8、細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況；采用5-aza誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化，顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)的變化，采用免疫熒光法檢測心肌細(xì)胞特異性蛋白Connexin43和TroponinⅠ在誘導(dǎo)后細(xì)胞上的表達(dá)情況。 2.采用密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞分離培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)骨髓單個核細(xì)胞，采用VEGF165和bFGF誘導(dǎo)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)的變化；采用免疫熒光法檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白F1k1和CD31在誘導(dǎo)后細(xì)

9、胞上的表達(dá)情況；將細(xì)胞接種在半固體凝膠上觀察細(xì)胞形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力；采用3H-TdR摻入法實驗和細(xì)胞劃痕實驗檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。 3.采用RT-PCR方法檢測大鼠骨髓MSCs上Notch信號受體和配體mRNA的表達(dá)情況；后面的實驗共分4組，A組：正常大鼠MSCs；B組：誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞；C組：導(dǎo)入了VEGF165基因的誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞；D組：阻斷了Notch信號的C組細(xì)胞。采用RT-PCR方法檢測四組細(xì)胞上N

10、otch信號受體和配體mRNA的表達(dá)差異；采用3H-TdR摻入法實驗和細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞增殖和遷移能力的變化；將細(xì)胞接種在半固體培養(yǎng)基上檢測細(xì)胞形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力。 結(jié)果： 1.大鼠骨髓MSCs的形態(tài)主要表現(xiàn)為長梭形和紡錘形，細(xì)胞表達(dá)整合素家族成員CD29、粘附分子CD44，但不表達(dá)造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、泛白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45；經(jīng)5-aza誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)變化不大，細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白Connex

11、in43和Troponin I。 2.大鼠MSCs經(jīng)VEGF165和bFGF誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由原來的長梭形、紡錘形變成圓形、橢圓形，細(xì)胞具備了內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特征；細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物F1k1和CD31；誘導(dǎo)后細(xì)胞能夠在半固體培養(yǎng)基上形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，且其增殖能力較大鼠MSCs有所降低（P<0.01），遷移能力有所增強（P<0.01）。 3.大鼠MSCs上表達(dá)有Notch信號受體Notch1和配體Jagged1的

12、mRNA；大鼠MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)后，細(xì)胞上Notch1和配體Jagged1的mRNA的表達(dá)無明顯變化，誘導(dǎo)后細(xì)胞的增殖能力下降（P<0.01），遷移能力增強（P<0.01）；給誘導(dǎo)后的內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)入VEGF165基因后，細(xì)胞上Notch信號配體Jagged1的mRNA的表達(dá)增強（P<0.01），細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力增強（P<0.05，P<0.01，P<0.05）；當(dāng)阻斷了誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞的Notch信號后，

13、細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力更進一步增強（P<0.05，P<0.05，P<0.05）。 結(jié)論： 1.大鼠MSCs體外向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化是可行的，誘導(dǎo)后的細(xì)胞獲得了部分心肌細(xì)胞的表型。 2.大鼠MSCs體外向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化是可行的，誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備部分內(nèi)皮細(xì)胞的表型，并獲得成熟內(nèi)皮細(xì)胞的功能。 3.大鼠MSCs上表達(dá)有Notch信號受體Notch1和配體Jagged1的mRNA。當(dāng)向