地黃多糖對大鼠脂肪間充質干細胞向心肌細胞誘導分化影響的研究.pdf

1、脂肪間充質干細胞(ADMSCs)是從脂肪組織中分離得到的間充質干細胞，是成體干細胞的一種。近年來大量研究證明ADMSCs與其它干細胞一樣既具有很強的自我更新能力，又具有多向分化的潛能。但由于ADMSCs來源充足、取材方便、給患者帶來的痛苦較小，同時又可以避免倫理學等問題，所以ADMSCs逐漸成為干細胞治療領域的一個新的焦點。近年來，隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率逐年升高，已經成為威脅人類健康的主要疾病，特別是急性心肌梗死、心

2、梗后心衰等疾病具有很高的病死率和致殘率。這是因為成熟心肌細胞屬于終末分化細胞，缺乏再生能力，所以一旦心肌細胞受到不可逆損傷時，心肌細胞數量減少，纖維瘢痕組織增生替代，最終發(fā)展成為心力衰竭。多年來臨床工作者不斷致力于心肌梗死后心肌保護和梗死后心衰預防及治療的研究。目前最有效的方法就是盡快實現心肌的再灌注，目的是保護和挽救存活的心肌細胞，從而保護心功能。再灌注療法確實能夠降低上述疾病的死亡率，但由于受到很多因素的影響，再灌注保護和挽救心肌細

3、胞的作用有限。ADMSCs由于具有多向分化潛能，成功誘導ADMSCs向心肌細胞方向分化，實現心肌細胞的再生及替代，自然成了解決這個難題的新思路。目前國內外已經有大量研究發(fā)現，ADMSCs能夠成功分化為心肌細胞，甚至觀察到了自主跳動心肌細胞的產生；在體的動物實驗發(fā)現ADMSCs移植后具有減小心肌梗死面積，改善心功能的作用。這些研究發(fā)現極大的鼓舞了世界各地的科研工作者。但由于ADMSCs研究尚處于起始階段，在實際應用中還有許多問題需要進一步

4、研究，比如怎樣增強ADMSCs在體外培養(yǎng)的增殖能力，從而既實現ADMSCs在體外大量擴增，又不影響其分化能力；ADMSCs移植到體內或梗死區(qū)后能否繼續(xù)存活，怎樣提高移植細胞在梗死區(qū)的存活率；如何提高ADMSCs向心肌細胞的轉化率等。這些問題的解決對ADMSCs盡快應用到臨床具有十分重要的意義。地黃多糖是中藥地黃的主要有效成分，從地黃的根莖中提取。研究發(fā)現地黃多糖可以明顯促進正常小鼠骨髓造血干細胞的增殖，對粒單系祖細胞和早、晚期紅系祖細胞

5、的增殖和分化亦有明顯促進作用。地黃提取物還可以不同程度的對抗肝微粒體脂質過氧化，從而降低組織的過氧化脂質水平，此外地黃多糖還具有增強免疫力、抗衰老、保護心、腦、腎臟和胃黏膜等多種生物學功能。傳統(tǒng)醫(yī)學博大精深，并且擁有豐富的中醫(yī)藥材。本實驗用地黃多糖作用于ADMSCs，旨在將祖國的傳統(tǒng)醫(yī)學與ADMSCs研究相結合，探索新的研究思路，希望能夠給ADMSCs研究帶來新的突破，為ADMSCs早日應用到臨床提供實驗依據。 目的：①分離、培

6、養(yǎng)大鼠ADMSCs，觀察地黃多糖對ADMSCs在體外培養(yǎng)時增殖能力和生物學性狀的影響；②用H2O2作用于ADMSCs，模擬ADMSCs移植到心肌梗死區(qū)的損傷，觀察地黃多糖對H2O2損傷ADMSCs的保護作用；③觀察地黃多糖對ADMSCs在體外經5-氮胞苷(5-aza)誘導后向心肌細胞轉化率的影響。 內容和方法：根據以上目的，本研究分成三個部分： 第一部分取體重約200g的Wistar雄性大鼠，在無菌條件下分離培養(yǎng)ADMS

7、Cs，對第3代細胞行免疫組織化學染色，鑒定其表面分子CD13、CD31、CD44、CD45、CD105等的表達。取第3代細胞用不同濃度地黃多糖干預，MTT法繪制細胞生長曲線；消化計數法測定不同時間點的細胞貼壁率；免疫組織化學染色鑒定其表面分子。 第二部分同樣方法獲取ADMSCs。取第3代ADMSCs，隨機分為6組，I：H2O2損傷組；A、B、C、D分別為H2O2損傷加地黃多糖各濃度作用組(1 mg/L、50 mg/L、100 m

8、g/L、200mg/L)；N：正常對照組，對應于分組，加入不同濃度地黃多糖培養(yǎng)24h，加250umol/L過氧化氫(H2O2)作用2h，誘導ADMSCs損傷，然后用MTT法檢測細胞存活情況，比色法檢測細胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)的水平。 第三部分同樣方法獲取ADMSCs．取第3代ADMSCs，采用濃度為10umol/L的5-氮胞苷誘導24小時，之后分為A、B兩組(A：對照組；B：濃度為200mg/L的地黃多糖干預組)繼續(xù)培

9、養(yǎng)4周，免疫組化染色法鑒定α-actin的表達，流式細胞儀檢測各組ADMSCs向心肌細胞的轉化率。 結果：大鼠附睪處脂肪組織中舍有大量ADMSCs，呈長梭形貼壁生長，免疫化學染色鑒定CD13、CD44，CD105陽性，CD31、CD45陰性；第3代ADMSCs具有活躍的增殖能力，加不同濃度地黃多糖干預后，ADMSCs的生長增殖能力均提高，而且呈濃度依賴性；ADMSCs接種后24小時貼壁率可達95％以上，地黃多糖對ADMSCs的貼

10、壁率無明顯影響；地黃多糖對ADMSCs表面分子表達無影響。 H2O2損傷組與正常對照組相比較，存活細胞顯著減少(P＜0.01)、LDH水平明顯增高(P＜0.01)。地黃多糖各濃度組與H2O2損傷組比較，存活細胞顯著增加(P＜0.01)，LDH水平明顯降低(P＜0.01)，而且呈濃度依賴性。 ADMSCs在體外經5-氮胞苷誘導后能夠成功分化為心肌細胞，α-actin染色陽性。200mg/L的地黃多糖干預組與對照組心肌細胞

11、的轉化率分別是57.89％和19.48％。兩組均未觀察到自主跳動的心肌細胞。 結論： 1． Wistar大鼠脂肪組織中含有大量ADMSCs；地黃多糖可以促進ADMSCs的生長增殖，而且不影響ADMSCs的表型，地黃多糖是ADMSCs在體外培養(yǎng)擴增的有利因素。 2．地黃多糖可以抑制H2O2引起的ADMSCs減少和細胞培養(yǎng)上清中LDH含量的升高，減輕H2O2對ADMSCs的損傷，對ADMSCs具有保護作用。