大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對心肌細胞電生理特征的影響.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療心臟疾病可以提高心臟功能，改善心室重構(gòu)，但干細胞對心臟電重構(gòu)有何作用，尤其對病理狀態(tài)下的心肌細胞電生理特征有何影響，目前研究不多。本研究利用體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞，并誘導(dǎo)為病理細胞模型，與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)后，通過檢測心肌細胞電生理特征變化，來研究骨髓間充質(zhì)干細胞對心臟電重構(gòu)是否有改善作用。
　　方法：
　　1.分離SD乳鼠心肌細胞培養(yǎng)，并檢測其電生理特征。
　　2.分離SD大鼠

2、骨髓間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)傳代至第三代。
　　3.將SD乳鼠心肌細胞培養(yǎng)液中加入10-7mol/l血管緊張素Ⅱ培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)其為肥大心肌細胞，并通過BCA法測定心肌細胞總蛋白濃度及測量心肌細胞膜電容來驗證細胞已誘導(dǎo)為肥大心肌細胞。
　　4.將 SD乳鼠心肌細胞放入低氧培養(yǎng)箱（內(nèi)含5% CO2，94%N2，1%O2混合氣體）培養(yǎng)24h，取出后加入提前30分鐘通入氧氣飽和的含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，放入常規(guī)CO2培養(yǎng)箱

3、中繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)為缺氧-復(fù)氧心肌細胞，并通過測定培養(yǎng)液中LDH活力來反映心肌細胞缺氧損傷的程度。
　　5.利用Transwell培養(yǎng)板將SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與正常心肌細胞、肥大心肌細胞及缺氧-復(fù)氧心肌細胞進行非接觸共培養(yǎng)，對照組為人胚腎293細胞（HEK-293）與各組心肌細胞共培養(yǎng)，心肌細胞在下層，干細胞或HEK-293在上層，接種比例為10:1，共培養(yǎng)72h。
　　6.應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄正常心肌細胞、肥大心肌細

4、胞、缺氧-復(fù)氧心肌細胞及與干細胞或HEK-293細胞共培養(yǎng)的各組心肌細胞的動作電位（AP）及瞬時外向鉀電流（ITO），測量動作電位時程恢復(fù)至90%的時間（APD90），繪制瞬時外向鉀通道的電流-電壓曲線（I-V曲線）。
　　7.提取心肌細胞總蛋白，采用Western Blot方法檢測骨髓間充質(zhì)干細胞對心肌細胞瞬時外向鉀通道Kv4.2膜蛋白表達量的影響。
　　8.提取心肌細胞mRNA，采用實時定量PCR技術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細胞

5、對心肌細胞瞬時外向鉀通道Kv4.2 mRNA表達量的影響。
　　結(jié)果：
　　1. SD乳鼠心肌細胞培養(yǎng)液中加入濃度為10-7mol/l血管緊張素Ⅱ培養(yǎng)24h可成功誘導(dǎo)為肥大心肌細胞。肥大心肌細胞總蛋白濃度高于空白對照組（分別為128.4±17.6mg/well，n=6；103.4±8.9mg/well，n=8；p＜0.05)。全細胞膜片鉗技術(shù)測定肥大心肌細胞膜電容大于對照組（分別為36.39±16.13pF（n=28）；26

6、.14±7.83pF（n=35），p＜0.05）
　　2. SD乳鼠心肌細胞放入低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，后加入復(fù)氧培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)可誘導(dǎo)為缺氧-復(fù)氧心肌細胞，測定缺氧24h的細胞培養(yǎng)液中的LDH活力較對照組明顯升高（分別為547.20±42.12（n=9）；287.45±26.10（n=12）p＜0.05）。
　　3.應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)，測定各組心肌細胞的APD90，正常心肌細胞APD90為124.52±15.56ms，n

7、=16；BMSCs與正常心肌細胞共培養(yǎng)APD90為102.15±11.37ms，n=9；HEK-293與正常心肌細胞共培養(yǎng) APD90為126.31±11.04ms，n=8；肥大心肌細胞APD90為265.74±65.88ms，n=15；BMSCs與肥大心肌細胞共培養(yǎng)APD90為182.63±29.12ms，n=13；HEK-293與肥大心肌細胞共培養(yǎng)APD90為254.53±59.12ms，n=7；缺氧-復(fù)氧心肌細胞APD90為201

8、.74±35.88ms，n=12；BMSCs與缺氧-復(fù)氧心肌細胞共培養(yǎng)APD90為168.03±24.12ms，n=10；HEK-293與缺氧-復(fù)氧心肌細胞共培養(yǎng)APD90為212.17±19.06ms，n=8。BMSCs可縮短正常心肌細胞、肥大心肌細胞及缺氧-復(fù)氧心肌細胞的動作電位時程（p＜0.05）。HEK-293細胞對心肌細胞動作電位時程無影響（p＞0.05）。
　　4.瞬時外向鉀電流（ITO）：BMSCs與正常心肌細胞共培

9、養(yǎng)組的 ITO通道的平均電流密度值高于正常心肌細胞組和 HEK-293共培養(yǎng)組（p＜0.05）；BMSCs與肥大心肌細胞共培養(yǎng)組的ITO通道的平均電流密度值高于肥大心肌細胞組和HEK-293共培養(yǎng)組（p＜0.05）；BMSCs與缺氧-復(fù)氧心肌細胞共培養(yǎng)組的 ITO通道的平均電流密度值與缺氧-復(fù)氧心肌細胞組和HEK-293共培養(yǎng)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。
　　5. Western blot檢測結(jié)果顯示，BMSCs可上調(diào)

10、正常心肌細胞、肥大心肌細胞膜表面瞬時外向鉀離子通道Kv4.2蛋白的表達量（p＜0.05），對缺氧心肌細胞的影響無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。
　　6.實時定量 PCR檢測結(jié)果顯示，BMSCs可上調(diào)正常心肌細胞、肥大心肌細胞 Kv4.2 mRNA的表達量（p＜0.05），對缺氧心肌細胞的影響無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.肥大心肌細胞及缺氧-復(fù)氧心肌細胞的瞬時外向鉀離子通道電流密度降低，動作電位時程延