心肌缺血環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的電生理特征及其致心律失常性.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟病目前已成為嚴(yán)重危害人類健康的重大心血管疾病。通過干細(xì)胞移植修復(fù)或替代嚴(yán)重受損或壞死的心肌而改善心臟功能已成為新的研究熱點(diǎn)。大量臨床及基礎(chǔ)研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）移植可有效改善心肌梗死（myocardial infarction, MI）后的心臟功能。但同時也有部分研究觀察到個別心肌梗死患者接受骨髓干細(xì)胞移植后可發(fā)生室性心律失常，推測其可能與骨髓

2、干細(xì)胞移植后形成異常的電生理特性有關(guān)。因?yàn)楦杉?xì)胞分化具有環(huán)境依賴性，在心肌缺血微環(huán)境下，既存在周圍正常的心肌細(xì)胞，也存在受損或異常的心肌細(xì)胞和纖維瘢痕組織等，移植的干細(xì)胞可能會沿著不同的方向分化而獲得不同于正常心肌細(xì)胞的電生理特性，對移植后心律失常的產(chǎn)生可能起著重要作用。因此，移植的干細(xì)胞在體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境下，具有怎樣的電生理特性以及是否可引起嚴(yán)重的室性心律失常亟需進(jìn)一步研究，這將為干細(xì)胞移植的安全應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。
　　研

3、究目的：
　　動態(tài)觀察在體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境下，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的電生理特性及其致心律失常性。
　　研究方法：
　　①運(yùn)用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠骨髓MSCs；采用攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因的慢病毒載體感染標(biāo)記MSCs；通過MTT檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，體外誘導(dǎo) MSCs向成骨、脂肪、軟骨方向分化而評價GFP標(biāo)記對MS

4、Cs生物學(xué)特性的影響。②采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)建立大鼠MI模型。心肌梗死2 w后，MI大鼠被隨機(jī)分為MI組、MI-DMEM組（接受DMEM培養(yǎng)基移植）和MI-MSCs組（接受MSCs移植）。MI-MSCs組：將6×106個GFP標(biāo)記的MSCs（150μL DMEM細(xì)胞懸液）采用心外膜下注射的方法移植到MI周邊區(qū)，MI-DMEM組采用同樣方法將相同量的DMEM培養(yǎng)基注射到MI大鼠相應(yīng)部位的心外膜下。③運(yùn)用小動物活體熒光成像和熒光顯微鏡

5、下組織切片直接觀察技術(shù)觀察MSCs移植后3 d、5 d、7 d、9 d和11 d的存活情況；采用CD4、CD8免疫熒光染色和TUNEL凋亡染色評價免疫排斥和凋亡對MSCs存活的影響。④運(yùn)用免疫熒光染色和激光捕獲顯微切割結(jié)合Real-time PCR技術(shù)觀察MSCs移植后3 d、5 d、7 d心肌離子通道亞單位（Kv1.4、Kv4.2、Kir2.1、Nav1.5、Cav1.2）和心肌特異性標(biāo)志物（α-actin、MYH、cTnI、Cx43

6、）蛋白和mRNA的表達(dá)。⑤采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄MSCs移植后3 d，Na+、K+、Ca2+膜電流的表達(dá)。⑥通過體表心電圖記錄MSCs移植前1 d、移植過程中及移植后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d的心電圖改變。⑦通過程序性電刺激觀察MSCs移植后8 w室性心律失常的發(fā)生。
　　研究結(jié)果：
　?、僭?MSCs呈梭形、集落樣貼壁生長，傳代后增殖速度加快，細(xì)胞形態(tài)、大小及分布漸趨一致。

7、GFP標(biāo)記的MSCs仍呈典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，增殖能力與未標(biāo)記的MSCs相似；其仍高表達(dá)表面抗原CD29、CD44、CD90和CD105，而不表達(dá)CD34和CD45；體外誘導(dǎo)具有向成骨、成脂肪、成軟骨方向分化的能力。②移植后第7 d，存活的MSCs僅為移植后第3 d的0.39％，移植后第9 d，MSCs丟失殆盡。移植區(qū)域未見CD4、CD8陽性細(xì)胞的聚集；TUNEL染色發(fā)現(xiàn)移植的MSCs發(fā)生了凋亡。③在體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境下，MSCs在蛋

8、白和mRNA水平上表達(dá)心肌離子通道亞單位（Kv1.4、Kv4.2和Kir2.1）和心肌特異性標(biāo)志物（MYH、cTnI和Cx43），不表達(dá)Nav1.5、Cav1.2、α-actin；膜片鉗記錄顯示：MSCs表達(dá)功能性K+電流（Ito，IK1和IK,DR），而不表達(dá)Na+電流和Ca2+電流。④MSCs移植后連續(xù)8 w的心電圖監(jiān)測顯示：室性心律失常累積發(fā)生率在MI組（66.67%，10/15）、MI-DMEM（64.29%，9/14）組和MI

9、-MSCs組（58.82%，10/17）間無顯著差異。各組間未發(fā)生室性心律失常但在移植前有明顯QRS波延長的大鼠，在MSCs移植后QRS波明顯縮短（MI-MSCs：18.2±0.4 ms，vs. MI：24.5±1.0 ms，MI-DMEM：24.7±1.0 ms；P<0.01）。⑤程序性電刺激誘導(dǎo)室性心律失常的發(fā)生在MI-MSCs組（41.20%，n=17）明顯低于MI組（86.67%，n=15）和MI-DMEM組（92.86%，n=

10、14）（P<0.0125）；心室有效不應(yīng)期在MI-MSCs組（56.0±8.8 ms）相對于MI組（47.7±8.8 ms）和MI-DMEM組（45.7±6.2 ms）明顯延長（P<0.01）。
　　研究結(jié)論：
　　①在體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境下，大鼠骨髓 MSCs不能完全獲得正常心室肌細(xì)胞的電生理特性，但同時也不促進(jìn)室性心律失常的發(fā)生。②移植的MSCs在體內(nèi)心肌缺血微環(huán)境下不能長期、有效存活，此與MSCs的凋亡相關(guān)而與移植的免疫