外加磁場引導下骨髓間充質(zhì)干細胞靶向修復缺血心肌的實驗研究.pdf

1、干細胞移植是缺血性心臟病和心力衰竭富有潛力的治療手段，但移植細胞停留率低下嚴重制約了功能效應的改善，因而提高移植細胞歸巢效率具有重要的現(xiàn)實意義。
　　本研究立足于細胞磁靶向研究的最前沿，對外加磁場引導下骨髓間充質(zhì)干細胞靶向修復損傷心肌進行了系統(tǒng)深入的研究。首先，在通過磁場物理學原理分析永磁鐵磁場特性的基礎上，對磁標記MSCs的磁響應性進行體外實驗研究，發(fā)現(xiàn)磁標記MSCs具有很強的磁響應能力，在體外能夠被磁場大量捕獲，細胞捕獲率隨磁

2、場強度增強而增加，隨流速增加而減少，為磁靶向細胞移植的動物實驗提供了理論依據(jù);其次，通過多模態(tài)影像學和染色體錯配技術對順向冠脈注射MSCs治療大鼠心肌損傷進行“磁場強度-療效”關系的研究，證實外加磁場以磁場強度依賴的方式增強MSCs的停留，首次發(fā)現(xiàn)過高的磁場強度并未帶來額外的心功能獲益，呈現(xiàn)“細胞停留-療效改善相分離”的矛盾現(xiàn)象，可能與永磁鐵的磁場強度呈現(xiàn)橫軸極化引發(fā)的細胞微栓塞有關;最后，提出經(jīng)左頸內(nèi)靜脈插管進行小動物逆向冠脈注射細胞

3、的新方法，在此基礎上發(fā)現(xiàn)外加磁場能夠促進心梗大鼠逆向冠脈注射MSCs的停留、植入，進一步減輕左室重塑和改善心功能，而且不存在細胞栓塞的風險。
　　研究結(jié)果顯示，細胞磁靶向治療有望成為促進移植細胞歸巢的新興策略。
　　第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及磁化標記
　　目的:確定超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO)和DiR熒光染料標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的合適方案。
　　方法:分離、培養(yǎng)和鑒定MSCs后，首

4、先用不同濃度的SPIO標記MSCs24h，權衡標記效率（普魯士藍染色、細胞透射電鏡檢查）和標記毒性確定合適的SPIO標記方案;再以5μg/ml的DiR工作液分別標記懸浮和貼壁狀態(tài)MSCs，以DAPI標記細胞核，通過熒光顯微鏡觀察標記效率，確定DiR的有效標記濃度。
　　結(jié)果:(1)25，50，100μg/ml的SPIO培養(yǎng)液對MSCs的標記效率均接近100％(P＞0.05)，但是SPIO濃度由25μg/ml增加到50μg/ml時，

5、可見較多藍染鐵顆粒黏附于細胞表面，少數(shù)游離于細胞外;當培養(yǎng)液SPIO濃度進一步增加到100μg/ml時，較多鐵顆粒游離出細胞外，而且出現(xiàn)少數(shù)細胞溶解。以“25:0.75μg/mlSPIO-PLL24h方案”標記MSCs，電鏡檢查顯示胞質(zhì)內(nèi)有含鐵致密顆粒囊泡，細胞超微結(jié)構未見破壞。(2)依據(jù)熒光顯微鏡觀察顯示DiR標記MSCs的效率接近100％，確定“5μg/ml的DiR工作液”能夠有效標記MSCs。
　　結(jié)論:權衡標記效率和標記毒

6、性，確定“25:0.75μg/ml SPIO-PLL24h標記方案”和“5μg/ml DiR工作液”可高效、安全標記大鼠MSCs。
　　第二部分永磁鐵的磁場特性和磁標記間充質(zhì)干細胞的體外磁響應性研究
　　目的:闡明圓柱體永磁鐵的磁場特性，明確體外靜態(tài)及流態(tài)磁標記MSCs的磁響應能力。
　　方法:對永磁鐵的磁場特性進行磁場物理學分析;對靜態(tài)磁標記MSCs施加0.21 T的環(huán)形磁鐵，通過磁共振成像及倒置相差顯微鏡觀察細胞在

7、磁場中的再分布;1×106磁標記MSCs以5mm/s流過一石英管，在中段管壁上分別放置0.15T、0.3 T和0.6T的磁鐵作為不同強度磁靶向組，對照組未放置磁鐵，通過計算細胞捕獲率觀察不同強度磁場對流態(tài)MSCs的捕獲效應;對0.6T磁靶向組分別設置4，20，100和500mm/s4種流速，觀察不同流速對0.6T磁鐵捕獲細胞的影響。
　　結(jié)果:通過磁場物理學分析得出永磁鐵的磁場沿z軸旋轉(zhuǎn)對稱，半徑(r)不變時，磁感應強度隨z的增加

8、而減少;z不變時，磁感應強度從中心(O)到圓柱體側(cè)面逐漸增大，在圓柱體側(cè)面磁感應強度最大，r再繼續(xù)增大，磁感應強度又逐漸減少。靜態(tài)磁標記MSCs在磁場作用下重新分布，形成與磁鐵半徑對應的棕色圓環(huán)，磁共振成像顯示環(huán)行信號缺失區(qū);0.15 T、0.3 T和0.6 T的磁鐵對流態(tài)磁標記MSCs的捕獲率隨著磁鐵強度的增強而顯著提高（分別為44.67％±5.5％、68％±3％和80.3％±1.5％，組間比較P均＜0.05），對照組幾乎沒有細胞被捕

9、獲;當流速為4、20、100和500 mm/s，0.6T磁鐵對磁標記MSCs的捕獲率隨流速增加而顯著減少(分別為85.0％±3.6％、68.7％±4.7％、11.3％±4.5％和1.6％±0.75％，P均＜0.01)，磁標記MSCs在磁場中的捕獲率與流速（(v)）呈負相關(R=-0.770; P=0.003)。
　　結(jié)論:磁標記MSCs具有很強的磁響應能力，在靜態(tài)和流態(tài)情況下能夠被磁場大量捕獲;細胞捕獲率隨磁場強度增強而增加，隨流

10、速增加而減少;磁標記MSCs在磁場作用下呈橫向極化分布，由此引起了我們對磁靶向干細胞移植可能導致或加重微栓塞的擔憂。
　　第三部分外加磁場引導下經(jīng)冠狀動脈順向移植間充質(zhì)干細胞治療大鼠缺血心肌的研究
　　目的:為了觀察外加磁場對在體移植細胞的靶向停留效果，我們進行了不同強度磁場下經(jīng)冠狀動脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞治療缺血再灌注大鼠的實驗研究。
　　方法:將雌性SD大鼠建立缺血再灌注模型后隨機分為5組，每組25只:(1)PBS

11、組:左室內(nèi)注射PBS;(2)0T組:左室內(nèi)注射MSCs，未行磁靶向;(3)0.15T組:左室內(nèi)注射MSCs，使用0.15T的磁鐵實施磁靶向;(4)0.3 T組:左室內(nèi)注射MSCs，使用0.3 T的磁鐵實施磁靶向;(5)0.6 T組:左室內(nèi)注射MSCs，使用0.6T的磁鐵實施磁靶向。所有注射的MSCs均取自雄性SD大鼠，細胞量為1×106，均標記SPIO和DiR，注射期間阻斷主、肺動脈5秒，對3個磁靶向組分別緊貼靶病變部位處(控制距離0-

12、1mm)放置0.15T，0.3 T和0.6 T磁鐵自注射開始持續(xù)至注射后10分鐘。通過離體心臟熒光成像和定量PCR檢測雄性MSCs的SRY基因來評估停留細胞量，通過組織形態(tài)學和心超檢測評估心臟的功能學效應。
　　結(jié)果:注射后24小時，SRY基因的RT-PCR檢測結(jié)果顯示0.15T、0.3 T和0.6T組的細胞停留率分別是0T組的1.45倍、2.76倍和3.86倍（分別為3.75％±0.44％、7.13％±0.28％、9.95％±0

13、.53％和2.58％±0.58％，組間比較P均＜0.001），而且磁場強度與細胞停留量之間呈現(xiàn)正相關(R=0.983，P=0.017)。將PBS組作為陰性對照，在細胞移植后24小時，對大鼠心臟進行熒光成像，3個磁靶向組大鼠心臟均探測到比0T組更強的紅色熒光（P均＜0.001），其中0.6 T組的熒光信號最強，0.3 T組次之，0.15 T組最弱，同RT-PCR的檢測結(jié)果一致。在細胞移植后3周，與0T組比較，RT-PCR結(jié)果顯示0.15

14、T組和0.3 T組移植細胞植入均顯著增多;組織形態(tài)學分析和心超結(jié)果顯示左室重塑明顯減弱和左室功能顯著改善，尤以0.3 T組的治療效應最強。然而，由于大量微血管栓塞，雖然0.6 T組細胞停留率最高，但治療效應與0T組無顯著差別。
　　結(jié)論:順向冠脈移植時，外加磁場以磁場強度依賴的方式增強MSCs的停留，進而得到心臟的功能學獲益，但過高的磁場強度則有加重微栓塞的風險，因而并未帶來額外的心功能獲益，導致“細胞停留-療效改善相分離”的矛盾

15、現(xiàn)象。
　　第四部分外加磁場引導下經(jīng)冠狀靜脈逆向移植間充質(zhì)干細胞治療大鼠缺血心肌的研究
　　目的:為了探索磁靶向能否增強逆向冠脈注射細胞的停留，我們對心梗大鼠進行了外加磁場引導下逆向冠脈注射間充質(zhì)干細胞的實驗研究。
　　方法:使用雌性SD大鼠建立急性心梗模型，選用前端塑形導絲插入左頸內(nèi)靜脈至左側(cè)冠狀靜脈，再用一導管沿導絲送達左冠狀靜脈近中段，對心梗大鼠逆向冠脈注射1×106 MSCs，在注射期間及注射后10分鐘緊貼心臟

16、表面放置0.6 T的磁鐵，通過SRY基因的RT-PCR檢測、心臟磁共振和離體心臟熒光成像等多模態(tài)影像學檢查來評估心臟停留細胞量，通過組織形態(tài)學和心超檢測評估心臟的功能學效應。
　　結(jié)果:注射后24小時，心臟磁共振成像半定量分析顯示磁靶向組大鼠左室前壁的相對信號強度低于無磁靶向組（0.61％±0.06％ vs0.88％±0.08％，P＜0.01），心臟離體熒光成像顯示，磁靶向組熒光信號是無磁靶向組的2.73倍（26222±5102v