犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:心肌梗死是嚴(yán)重危害中老年人身體健康的常見病、多發(fā)病。由于成人心肌組織無分化再生能力，其壞死心肌細(xì)胞只能由成纖維細(xì)胞取代而形成無收縮功能的瘢痕組織，終致心衰，甚至猝死，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和壽命。目前各種治療心肌梗死的方法如藥物、介入、手術(shù)治療僅適于80％的患者，且只能改善心肌缺血，不能挽救壞死心肌，對于上述方法無效的20％患者尚無有效的方法。心臟移植雖能取代病損心臟，但供體難選、技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用高而限制了其廣泛應(yīng)用。基因治療的有

2、效發(fā)揮亦依賴于一定數(shù)量有功能的心肌細(xì)胞。 目的:(1)探討分離、培養(yǎng)、純化和鑒定犬MSCs方法，觀察MSCs體外培養(yǎng)增殖的生長特征；(2)制備犬心肌梗死模型，¨天后運(yùn)用超聲心動圖及99mTc．MIBI靜息心肌灌注顯像(SPECT)對其心功能改變情況進(jìn)行評價；(3)探討自體MSCs移植對犬心肌梗死的治療意義，旨在為干細(xì)胞治療心肌梗死的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法:第一部分：探討了犬MSCs的體外分離、純化、擴(kuò)增和鑒定。首先采用

3、密度為1．073g／mL的Percoll分離液分離犬骨髓中的單個核細(xì)胞，進(jìn)而獲得MSCs，用IMEM+10％胎牛血清作為基本培養(yǎng)基，通過及時、反復(fù)傳代對MSCs進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng)，平均每7天在細(xì)胞達(dá)70-80％融合時，傳代一次。10mi骨髓體外擴(kuò)增2代后可獲得(1．2．1．35)×107個細(xì)胞。測定生長曲線，形念學(xué)觀察。流式細(xì)胞儀檢測擴(kuò)增后MSCs細(xì)胞周期及表面抗原特性。第二部分：通過結(jié)扎犬冠狀動脈左前降支近端建立心肌梗死模型，并進(jìn)行臨

4、床評價。選取雜種犬14只，體重12～18Kg。建立模型前進(jìn)行心電圖、超聲及SPECT檢查，了解基礎(chǔ)心電圖和心功能。常規(guī)麻醉實(shí)驗(yàn)犬，通過胸骨左緣第4肋間開胸，暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動脈前降支，建立AMI模型，同時行心電圖檢查?！旌笮谐曅膭訄D及SPECT檢查予以證實(shí)模型成功。第三部分：在第一、二部分研究的基礎(chǔ)上，觀察移植自體MSCs對犬心肌梗死的治療效果(心肌梗死面積、新生血管數(shù)量、心功能等)。心梗模型犬建立2周后隨機(jī)分為如下2組：組I(

5、MSCs組)，注射MSCs2ml，n=lO；組II(AMI對照組)，注射無血清IMDM培養(yǎng)基2mi，n=4。二次開胸于梗死部位注射干細(xì)胞或培養(yǎng)基，細(xì)胞移植前均經(jīng)4’，6’．二乙?；?．苯基吲哚(4',6'-diamidino-2．phenylindole，DAPI)標(biāo)記。所有動物于細(xì)胞移植后4周采用超聲心動圖評價心功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時處死動物，取出組織，主要觀察組織重構(gòu)和細(xì)胞存活等情況。結(jié)果(1)MSCs屬骨髓中單個核細(xì)胞，密度梯度離心結(jié)

6、合貼壁培養(yǎng)法能有效分離純化犬骨髓MSCs，MSCs在含lO％小牛血清的IMEM中生長性狀相對穩(wěn)定，1、3、5代細(xì)胞生長曲線基本一致，增殖速度快。細(xì)胞呈均一的成纖維細(xì)胞樣，流式細(xì)胞儀檢測表明MSCs強(qiáng)表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記CD44，而不表達(dá)造血干細(xì)胞特異抗原CD34、CDlla、CDl4和HLA-DR，屬非造血干細(xì)胞的另一群干細(xì)胞。細(xì)胞周期顯示有82．4％的細(xì)胞處于G0／G1期。(2)犬冠狀動脈前降支結(jié)扎后，心電監(jiān)護(hù)示心率加快和室性早搏，ST段壓

7、低：模型制備后¨天超聲心動圖顯示有室壁活動減弱，部分有室壁瘤存在，心梗區(qū)心肌變薄。射血分?jǐn)?shù)(EF)、每搏量(SV)、左室短軸縮短率(FS)下降，較結(jié)扎前差異顯著(P<0．05)，99mTc-MIBl示：心尖部、左室前壁、室間隔明顯充盈缺損，表明犬心梗模型制備成功。(3)細(xì)胞移植后4周，實(shí)驗(yàn)組和對照組共14例全部存活，超聲心動圖顯示實(shí)驗(yàn)組左室EF、SV、FS、LVD、LSD較移植前明顯改善(P<0．05)；而對照組(細(xì)胞培養(yǎng)液移植)4周后

8、左室EF、SV、FS、LVD、LSD較移植前差異不顯著(P>0．05)。實(shí)驗(yàn)組心功能改善程度較對照組差異顯著(P<0．05)。99mTc-MIBI檢查顯示：細(xì)胞移植組原心尖部、前壁缺損區(qū)再填充明顯，而對照組原心尖部、前壁缺損區(qū)再填充不明顯。 結(jié)論:(1)密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能有效分離、純化和擴(kuò)增犬骨髓MSCs，建立了體外分離、純化、培養(yǎng)擴(kuò)增犬骨髓MSCs的方法，為進(jìn)一步深入研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。(2)犬心梗模