同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子移植治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 傳統(tǒng)觀(guān)念認(rèn)為心肌是終末分化組織，梗死后由瘢痕組織修復(fù)，為保持心臟的泵血功能，進(jìn)而發(fā)生退行性左室重塑，心功能下降，最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)擁有多向分化的潛能，在心臟的微環(huán)境中可以分化為心肌樣細(xì)胞并表現(xiàn)其功能表現(xiàn)型，利用其移植替代壞死心肌阻止心臟衰竭的惡化進(jìn)程甚至修復(fù)受損心肌已成為目前心肌梗死治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。生長(zhǎng)因子在細(xì)胞的移行，存活以及分

2、化中具有重要作用，局部微環(huán)境中應(yīng)用生長(zhǎng)因子可以提高移植細(xì)胞的存活和功能，然而其效果并未得到明確證實(shí)。因此本研究在BMSCs與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growthfaCtor-1，IGF-1)，運(yùn)用激光捕獲分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)其心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4的表達(dá)研究生長(zhǎng)因子在干細(xì)胞分化過(guò)程中的重要作用。同時(shí)通過(guò)聯(lián)

3、合干細(xì)胞移植觀(guān)察其對(duì)于梗死后心肌的細(xì)胞治療作用。 方法： 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng) 取健康成年兔(5個(gè)月左右，體重2.0-2.5kg，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，于無(wú)菌條件下抽取兔股骨骨髓2-3mL，于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。2天后BMSCs黏附于培養(yǎng)瓶底，血細(xì)胞等懸浮于培養(yǎng)液中，每3～4d換液一次，4次后非貼壁細(xì)胞全部棄凈。心肌細(xì)胞取自新生兔(1-3天)心室，采用胰酶連續(xù)消化法分離細(xì)胞后

4、，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每2d換液1次。BMSCs與心肌細(xì)胞按1：1比例混合進(jìn)行共同培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入150 ng/ml HGF和200 ng/ml IGF-1，對(duì)照組不加。 2、心肌梗死模型的建立及細(xì)胞移植 取28只健康成年兔(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重2.0-2.5kg，隨機(jī)分為4組，每組7只，分別為：聯(lián)合應(yīng)用治療組，單純干細(xì)胞治療組，生長(zhǎng)因子治療組，安慰劑組為對(duì)照組。3％戊巴比妥鈉(3

5、0 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈麻醉，于胸骨左緣Ⅲ，Ⅳ肋間開(kāi)胸，充分暴露心臟。用眼科小圓針(5-0線(xiàn))在冠狀動(dòng)脈左室支主干第1，2對(duì)角支之間閉塞血管1小時(shí)后再灌注。心電圖Ⅱ?qū)?lián)上出現(xiàn)S-T段弓背樣抬高標(biāo)志建立缺血再灌注心肌梗死模型成功。MI術(shù)后3天，再次按原切口打開(kāi)胸腔，暴露心臟，選取心肌瘢痕周邊及中央共4個(gè)注射點(diǎn)，以微量注射器(10 ul)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及生長(zhǎng)因子。聯(lián)合應(yīng)用治療組(MSCs+GF)nl=7，給予MSC和生長(zhǎng)因子HGF，

6、IGF-1：混有MSCs 40ul(5x105/10ul)，8ul DMEM(150ng/mlHGF、200ng/ml IGF-1)。單純干細(xì)胞治療組(MSCs)n2=7：?jiǎn)为?dú)給予MSC(MSCs40ul)。生長(zhǎng)因子治療組(GF)n3=7，單獨(dú)給予生長(zhǎng)因子HGF，IGF-1：8ul DMEM(150ng/ml HGF、200ng/ml IGF-1)。對(duì)照組n4=7給予相同劑量DMEM培養(yǎng)液。 3、免疫化學(xué)染色 體外行細(xì)胞

7、共培養(yǎng)后，取培養(yǎng)后的細(xì)胞爬片，PBS清洗后，％4多聚甲醛固定30min，PBS洗5minx3，10％牛血清室溫封閉20min，吸出血清，加入兔抗-α-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，PBS清洗后，二抗應(yīng)用山羊抗兔IgG抗體。經(jīng)DAB試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染。細(xì)胞移植治療各組在心肌梗死后6周采集心臟標(biāo)本，行免疫熒光染色確定移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。一抗加入兔抗connexin 43單克隆抗體，4℃過(guò)夜。二抗應(yīng)用FITC(綠色熒光)—羊抗兔Ig

8、G抗體標(biāo)記結(jié)合。熒光顯微鏡下觀(guān)察DAPI+綠色激發(fā)光。 4、透射電鏡技術(shù) 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)緩沖液洗滌后于EP管內(nèi)固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，ULTRACUT E型超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色后，Hitachi H-600-4透射電鏡觀(guān)察拍照。 5、激光顯微切割系統(tǒng)捕獲BMSCs BMSCs與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)1天，3天，1周，2周，直到6周。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行肌纖維和核

9、的雙染色。兔抗-α-肌動(dòng)蛋白單克隆體和山羊抗兔過(guò)氧化物酶結(jié)合的IgG抗體用來(lái)標(biāo)記肌纖維，蘇木素復(fù)染標(biāo)記細(xì)胞核。選取表達(dá)α肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性并同時(shí)存在核分裂的細(xì)胞為由BMSCs分化來(lái)的心肌樣細(xì)胞，運(yùn)用激光顯微切割系統(tǒng)(Arcturus)進(jìn)行捕獲，每組捕獲大約500個(gè)細(xì)胞。 6、RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 使用PicoPureRNA分離試劑盒對(duì)捕獲的干細(xì)胞提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。模板cDNA由Taq HS DNA多聚

10、酶(0.1μl)在含有兔GATA-4的上下游引物(0.2μl)中進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：兔GATA-4，188bp，上游引物5’-GCCCCTCATcAAGCCTCAG-3’；下游引物5’-TCCCCTCTTTCCGCATCG-3’。Β-actin，315bp，上游引物5’-TTCCAGCCCTCCTTCCTG-3’；下游引物5’-GCCCGACTCGTCATACTCC-3、。PCR反應(yīng)體系45個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括變性94℃40 s，

11、退火60℃40 s，延伸72℃60 s，45個(gè)循環(huán)后最后延伸72℃5min；以β-actin為內(nèi)參。凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的密度，計(jì)算產(chǎn)物的相對(duì)量。 7、時(shí)實(shí)三維測(cè)定心功能 采用PHILIP公司IE33型超聲儀，三維探頭X-3獲取左室三維容積圖像。運(yùn)用儀器自帶的QLAB分析軟件進(jìn)行圖象切割及分析。在干細(xì)胞移植及生長(zhǎng)因子注射后6周對(duì)4組模型分別進(jìn)行三維測(cè)定。獲取左室收縮舒張末期容積參數(shù)，測(cè)算每搏輸出量及射血分

12、數(shù)(EF)。 結(jié)論： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)后可以分化成心肌樣細(xì)胞，并表達(dá)心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4。聯(lián)合應(yīng)用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，提高GATA-4的表達(dá)。單純干細(xì)胞移植與聯(lián)合生長(zhǎng)因子應(yīng)用都能有效改善心肌梗死后左室收縮功能，減輕室腔擴(kuò)大，提高心功能。然而聯(lián)合應(yīng)用生長(zhǎng)因子較單純干細(xì)胞移植對(duì)于心肌梗死后心功能的恢復(fù)并未出現(xiàn)更好的治療的效果。提示生長(zhǎng)因子對(duì)于干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化作用在