骨髓來源的間充質(zhì)干細胞靶向治療腦膠質(zhì)瘤的實驗研究.pdf

1、研究背景： 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤之一。因腫瘤細胞早期就有向周圍正常組織浸潤生長的特性，是膠質(zhì)瘤難以治療及容易復發(fā)的根源。雖然臨床應用手術、放療、化療等多種治療手段，患者的生存期并沒有得到明顯改善。能夠準確發(fā)現(xiàn)腫瘤的微衛(wèi)星灶，并將治療藥物靶向作用于腫瘤部位，是治療腫瘤的直接而有效的途徑，也成為目前眾多研究人員所致力解決的課題之一。 近來研究發(fā)現(xiàn)干細胞具有向腫瘤定向遷移的特性。利用干細胞為載體攜帶治療基因或藥物靶

2、向治療腫瘤可能是腫瘤治療的新突破。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞具有在不同的誘導條件下向中胚層組織細胞分化的能力，而且取材方便，體外分離與增殖技術成熟等特點，在干細胞移植和基因治療中頗受青睞。 因此我們首先建立穩(wěn)定可靠的動物膠質(zhì)瘤模型用以研究膠質(zhì)瘤的生長特征，同時分離大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞，并應用立體定向的方法給膠質(zhì)瘤大鼠接種MSCs細胞，通過活體動物檢測儀、細胞的體外增殖分析、免疫組化等方法觀察MSCs細胞在體內(nèi)及體外的遷移特性及對腫

3、瘤生長的影響。 第一部分構建穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶的9L<'luc>或MSC<'RL>細胞 首先通過酶切的方法獲得表達螢火蟲和海腎熒光素酶(F-luc和R-luc)的目的基因片段，將其連接到慢病毒表達質(zhì)粒pBPLV，構建慢病毒表達載體pBPLVPGL<,3>及pBPLV-RL，通過PCR，酶切或DNA序列測定方法證實克隆的目的基因序列完全正確后，將慢病毒表達載體通過脂質(zhì)體轉染到9L膠質(zhì)瘤細胞或骨髓間充質(zhì)干細

4、胞，應用無菌流式細胞分選儀分選出穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶的9 L<'luc>細胞或海腎熒光素酶的MSC<'RL>細胞，并擴增培養(yǎng)。將9L<'luc>或MSC<'RL>細胞梯度稀釋于96孔板中，分別加入螢火蟲熒光素酶底物D-luciferin或海腎熒光素酶檢測試劑，2-5min后放入暗箱中檢測。結果發(fā)現(xiàn)9L<'luc>/Msc<'RL>細胞所釋放的光子量均與細胞數(shù)量呈正相關，表明螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶已穩(wěn)定轉染入9L或MSC細胞。

5、 第二部分9L/Wistar腦膠質(zhì)瘤模型的構建及9L在Wistar大鼠及F344大鼠生長特性的對比觀察 取對數(shù)生長期的9L<'lcu>細胞，消化、離心，并進行細胞記數(shù)，調(diào)整為終濃度1×10<'5>/μl，并將DAPI與細胞充分混勻。取成年雄性Wistar大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，于前囟中點后1.0 mm，矢狀縫右旁開3.0mm用小型牙科鉆鉆孔。抽取1×10<'6>DAPI標記的9L<'luc>膠質(zhì)瘤細胞懸液，經(jīng)顱孔垂直于顱

6、骨外板進針5mm，以1μl/min的速度緩慢推注，手術過程均無菌操作。對照組動物注射等量的PBS。于細胞移植后0天，7天，14天，21天，分別給予腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-luciferin(150mg/kg)，將動物置于活體動物檢測儀密閉的暗箱中成像觀察腫瘤的生長狀況。檢測結束后，將動物脫頸處死，斷頭取腦。以注射部位為中心切取腦組織，HE常規(guī)染色，光鏡下觀察形態(tài)學變化并做GFAP和Vemintin的免疫組織化學染色觀察陽性物質(zhì)的分

7、布特點。 結果發(fā)現(xiàn)細胞移植后7天所有動物均可檢測到腫瘤發(fā)生，7天至21天腫瘤逐漸增大，光子量明顯增強。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)腦立體定位術后大鼠顱內(nèi)成瘤率100％，低倍鏡下可見腫瘤類似球形，與周圍腦實質(zhì)邊界較清楚，瘤內(nèi)可見出血，瘤周有腫瘤細胞浸潤，瘤周及瘤內(nèi)新生血管豐富。高倍鏡下腫瘤細胞形態(tài)多樣，核大，多核，核質(zhì)深染，核異形性高。而免疫組織化學檢測未發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞GFAP或Vemintin染色陽性，而腫瘤細胞問膠質(zhì)網(wǎng)可見陽性染色。結合H

8、E染色的形態(tài)學改變，符合低分化的惡性膠質(zhì)瘤的特征，表明9L/Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模型構建成功。 本研究隨之比較9L膠質(zhì)瘤細胞在Wistar大鼠及F344大鼠的生長特性采用立體定向手術，在Wistar大鼠或F344大鼠右側尾狀核接種1×10<'5>的9L<'luc>細胞，分別于接種后7，14，21天通過活體動物體內(nèi)成像系統(tǒng)檢測腫瘤的生長情況，并于檢測結束后斷頭取材，觀察腫瘤的形態(tài)學變化，采用免疫組化的方法檢測腫瘤細胞GFAP，

9、Vemintin的表達，及大鼠腦內(nèi)淋巴細胞浸潤情況。 結果發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠或F344大鼠顱內(nèi)接種9L<'luc>細胞后成瘤率100％，腫瘤組織病理學均具有惡性膠質(zhì)瘤的特點；BLI檢測發(fā)現(xiàn)9L<'luc>/F344膠質(zhì)瘤逐漸增大，而Wistar大鼠在接種同等數(shù)量的9L<'luc>膠質(zhì)瘤細胞后僅于第7天可檢測到腫瘤生長，之后即消失，而且在腫瘤局部可見大量CD<,4>，CD<,8>陽性淋巴細胞浸潤；而在9L<'luc>/F344模

10、型中未見CD<,4>、CD<,8>陽性細胞。 第三部分：骨髓間充質(zhì)干細胞向腫瘤的趨化研究 取生長狀態(tài)良好的9L細胞培養(yǎng)48h，收上清。在24孔板的中加入無血清的9L上清600μl，將Transwells憩室沒入其中，將體外培養(yǎng)的F344大鼠MSCs消化離心，每個Transwells板中加入2×10<'5>cells，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。光鏡下觀察結果，隨機選取5個視野計數(shù)，觀察MSC細胞的體外遷移情況。 同時取對數(shù)

11、生長期的9L細胞，標記PKH26染料，進行細胞計數(shù)，使其終濃度為2×10<'4>/μl，通過立體定向方法于裸鼠的顱內(nèi)接種標記PKH26的9L細胞(1×10<'5>)。接種細胞后7天，再次通過立體定向方法于膠質(zhì)瘤裸鼠對側腦實質(zhì)接種MSC<'RL>細胞(1×10<'6>)，接種位置為前囟中點后1.0mm，矢狀縫左旁開3.0mm。對照組為未接種膠質(zhì)瘤細胞，僅接種同等量的MSC<'RL>細胞。整個實驗均在無菌條件下操作。于接種MSC<'RL>后

12、0，7，14天分別于活體動物檢測儀中觀察MSC<'RL>細胞的遷移情況，并于預定時間將動物脫頸處死后取腦組織做冰凍切片，熒光下觀察細胞的遷移情況。 結果發(fā)現(xiàn)MSCs在體外無自發(fā)遷移的特性，而在Transwell板底層的小室中加入9L細胞的條件培養(yǎng)基時，MSCs細胞發(fā)生遷移，且遷移能力與9L細胞的數(shù)目呈正相關。通過活體動物體內(nèi)成像同樣觀察到膠質(zhì)瘤裸鼠接種MSC<'RL>細胞后0天多集中于注射部位，而第7天時，可發(fā)現(xiàn)MSC<'RL>

13、細胞向中線遷移，原注射部位細胞減少，光子量減低；注射后第14天，可見部分細胞已遷移到原注射部位對側，即腫瘤側。而未接種膠質(zhì)瘤細胞的動物MSC<'RL>細胞則多位于注射原部位，未發(fā)生遷移。動物檢測結束后，脫頸處死，將腦組織冰凍切片熒光顯微鏡下可觀測到攜帶有綠色熒光蛋白的MSCs遷移到腫瘤組織周圍，在腫瘤與正常腦組織的邊界分布較多。 第四部分：骨髓間充質(zhì)干細胞對腫瘤生長作用的實驗研究 首先觀察體外MSCs對膠質(zhì)瘤細胞增殖的影

14、響。在6孔細胞培養(yǎng)板中，接種9L<'luc>大鼠膠質(zhì)瘤細胞，1.3×10<'5>/孔進行單獨培養(yǎng)或應用9L<'luc>大鼠膠質(zhì)瘤細胞及MSCs或HEK細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。在普通顯微鏡下計各孔細胞總數(shù)，熒光顯微鏡下計9 L<'luc>細胞數(shù)，然后胰蛋白酶消化細胞，應用流式細胞儀分別計數(shù)各孔熒光細胞數(shù)。 在體觀察MSCs對腫瘤生長的影響，在F344大鼠顱內(nèi)接種9 L<'luc>細胞后7天，通過立體定向方法分別于膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤原

15、位(即前囟中點后1.0mm，矢狀縫右旁開3.0mm，深度為4mm)、同側腦室(前囟中點后3.0mm，矢狀縫右旁開1.0mm，深度為2mm)、對側腦實質(zhì)(前囟中點后1.0mm，矢狀縫左旁開3.0mm，深度為4mm)及股靜脈接種MSCs細胞。于接種MSCs細胞后0，7，14天通過BLI在體觀察MSCs對膠質(zhì)瘤生長的影響。檢測結束后，灌注固定，以注射部位為中心切取腦組織，行HE常規(guī)染色和CD<,4>、CD<,8>的免疫組化染色，于光鏡下觀察形

16、態(tài)學變化及大鼠腦內(nèi)CD<,4>，CD<,8>淋巴細胞浸潤情況。 本研究通過將9 L<'luc>與MSCs或HEK細胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)9 L<'luc>細胞單獨培養(yǎng)3天后，流式細胞儀檢測9L<'luc>細胞數(shù)為1.0925±0.068×10<'6>；與HEK細胞共培養(yǎng)3天后，9 L<'luc>細胞數(shù)為1.97±0.150×10<'6>；而與MSCs細胞共培養(yǎng)3天后，9L<'luc>細胞數(shù)為0.14±0.016×10<'6>，表明膠質(zhì)

17、瘤細胞的生長受到明顯抑制(P<0.01)。在體研究同樣觀察到MSCs抑制膠質(zhì)瘤的生長。將F344大鼠顱內(nèi)接種9L<'luc>細胞7天后，采用不同方式移植MSCs細胞，細胞移植后0，7，14天通過BLI檢測觀察腫瘤的生長情況。MSCs細胞移植當時檢測各組動物腫瘤的生長基本均衡；于MSCs移植后7天，與對照組相比，接受MSCs治療的動物膠質(zhì)瘤的生長速度有所增快，但移植后14天腫瘤卻比第7天明顯縮小，部分動物腫瘤甚至檢測不到。同時本研究采用免

18、疫組織化學的方法觀察到在未接受MScs治療的9L<'luc>/F344膠質(zhì)瘤大鼠中未見CD<,4>、CD<,8>陽性細胞；而在給予MsCs治療的膠質(zhì)瘤大鼠，腫瘤組織內(nèi)CD<,4>，CD<,8>陽性淋巴細胞多見，浸潤明顯。 結論：本研究通過制造大鼠的腦膠質(zhì)瘤模型并觀察MSCs在體及離體對腫瘤的遷移及對腫瘤生長的作用發(fā)現(xiàn)MSCs細胞可以向膠質(zhì)瘤遷移，并抑制腫瘤的生長，其作用的發(fā)揮可能是通過調(diào)動機體的免疫細胞或自身分泌的細胞因子有關，