大鼠骨髓間充質干細胞靶向膠質瘤遷移及其時空分布的實驗研究.pdf

1、目的： (1)探討骨髓間充質干細胞(MSCs)靶向膠質瘤遷移的能力。 (2)明確超順磁性氧化鐵納米粒子(SPIO)體外標記MSCs的適當濃度和不同標記濃度對細胞的生物學活性影響。 (3)應用1.5T MRI探討MSCs靶向顱內膠質瘤遷移的分布模式。 (4)探討單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和基質細胞衍生因子-1a(SDF-1a)在MSCs靶向膠質瘤遷移過程中的作用。 方法： (1)分離

2、培養(yǎng)大鼠MSCs，應用增強型綠色熒光蛋白(EGFP)標記MSCs，觀察MSCs在體外向膠質瘤細胞遷移的模式，Transwell系統定量分析MSCs的遷移能力。將LacZ標記的MSCs經靜脈注入膠質瘤苛瘤大鼠體內，2 w后取下腦、心臟、肺臟、肝臟和腎臟進行x-gal染色觀察MSCs在腦膠質瘤苛瘤大鼠的全身分布。 (2)體外不同濃度SPIO標記MSCs，觀察不同標記濃度細胞活力的改變及標記率，測量并繪制未標記細胞和標記細胞的MTT生

3、長曲線，選取適當濃度標記量。 (3)運用SPIO和EGFP雙重標記MSCs，靜脈移植雙標細胞后應用MRI觀察MSCs在顱內膠質瘤的時空分布。普魯士藍和免疫熒光染色檢測MSCs靶向顱內膠質瘤遷移的分布模式。 (4)通過RT-PCR及流式細胞儀檢測第二代MSCs表達趨化因子受體CCR2和CXCR4的情況；利用Transwell系統探討趨化因子MCP-1和SDF-1a對MSCs的體外趨化作用；抗體阻斷后觀察其對MSCs的膠質瘤

4、趨向性的影響。 結果： (1)將轉染AAV-EGFP的MSCs與F98膠質瘤細胞共同培養(yǎng)后，綠色的MSCs聚集于F98克隆中，而在其它部位均不見綠色MSCs的分布。在不同時間點觀察到MSCs在體外向膠質瘤細胞遷移的現象，隨著觀察時間的延長，更多的綠色MSCs向F98克隆聚集。體外研究顯示正常腦組織溶解物或生理鹽水不能刺激MSCs和成纖維細胞向其遷移，F98膠質瘤溶解物和F98膠質瘤細胞能顯著誘導MSCs向其遷移。單因素方

5、差分析表明不同類型細胞遷移能力存在顯著不同(F=22.34；P<0.001)，不同刺激因素誘導MSCs的遷移能力也存在顯著的不同(F=7.65；P=0.0002)。MSCs體外遷移能力明顯強于成纖維細胞；F98膠質瘤細胞和F98膠質瘤溶解物較其它刺激因素具有更強的趨化作用。MSCs經靜脈移植14 d后，X-gal染色觀察藍色細胞很少分布于檢測器官，而在腦腫瘤中則有大量藍色的MSCs分布于其中。腦腫瘤內的藍色MSCs(97.52±16.1

6、3/section)顯著高于對側正常腦組織(7。64±2.31/section)和其它器官(心臟：O/section；肺臟：3.76±1.74/section；肝臟：9.64±1.55/section；腎臟：19.78±2.63/section；脾臟：5.74±1.98/ection)(P<0.001)。 (2)體外標記的MSCs普魯士藍染色見細胞漿內有許多藍染的鐵顆粒。25μg/ml標記組孵育24 h和72 h后，臺盼藍染色計

7、數死細胞數約為12％-15％，與未標記細胞(約15％)相比無明顯統計學差異。在100μg/ml和250μg/ml標記組孵育24h和72h后，臺盼藍染色計數活細胞數(約57％-78％)明顯低于未標記細胞組(約85％)(P<0.001)。MTT法檢測發(fā)現SPIO標記MSCs的增殖活力與未標記MSCs相比無改變。1d，3d，1w和2w時測得的OD值比較，兩組之間比較無統計學差異。 (3)移植7d后，SPIO/EGFP雙標細胞侵入腫瘤中

8、，散布于腫瘤內部。14d后，雙標細胞不再分布于腫瘤內部，大多數位于腫瘤和正常腦組織之間沿腫瘤邊界分布。雙標MSCs不僅分布于侵入邊緣或腫瘤內部，并能夠追蹤浸潤正常腦組織的腫瘤細胞。1.5 TMRI掃描發(fā)現，雙標細胞經靜脈移植7d后，腫瘤內部呈現一小片界限清晰的低信號暗區(qū)，而在移植未標記細胞的對照組則沒有信號改變。14d后，在腫瘤的邊緣呈現為不連續(xù)的弧形低信號。MRI顯像所示低信號區(qū)與組織切片普魯士藍染色相符合。 (4)MSCs表

9、達趨化因子受體CCR2和CXCR4；當MCP-1濃度為4、20 nh/ml時，MSCs的遷移數量較對照組有顯著性差異(P<0.01)，100、500ng/ml組較對照組無顯著性差異。SDF-1a誘導MSCs的趨化作用呈劑量依賴關系，在100 ng/ml濃度時達高峰；抗MCP-1抗體或抗CXCR4抗體顯著抑制膠質瘤細胞條件培養(yǎng)基對MSCs的趨化作用。 結論： (1)MSCs具有高度特異性地向膠質瘤遷移的能力。 (2