成神經(jīng)細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)C6膠質(zhì)瘤的趨向性研究.pdf

1、在神經(jīng)外科領(lǐng)域，膠質(zhì)瘤的治療一直是神經(jīng)外科工作者面臨的最大挑戰(zhàn)之一，因?yàn)槟z質(zhì)瘤在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病中發(fā)病率最高，約占全部原發(fā)性腫瘤的40％-50％左右。目前臨床上治療膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，輔以化療、放療、中醫(yī)治療、免疫治療等手段進(jìn)行綜合治療。這種方案雖能產(chǎn)生一定療效，但膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然不容樂觀。靶向治療的出現(xiàn)給我們帶來了新的希望，但由于攜帶目的基因或藥物的病毒載體存在半衰期短、趨向性弱和安全性等問題，目前未能取得預(yù)期的療效，值得我們深

2、入研究。
　　最近，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）作為一種新型的載體而備受科學(xué)工作者的關(guān)注。BMSCs來源于中胚層，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。與神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell,NSC)和胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,ESC)等相比，BMSCs具容易獲取、方便培養(yǎng)、低免疫原性、不涉及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，近年來已成為干細(xì)胞領(lǐng)域

3、研究的熱點(diǎn)。根據(jù)BMSCs具有的生物學(xué)特性和對(duì)腫瘤的趨向性，目前很多研究者關(guān)注其在膠質(zhì)瘤靶向治療中的應(yīng)用，將其作為一種載體用于膠質(zhì)瘤的治療成為的研究熱點(diǎn)。而BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定、分化等基礎(chǔ)研究，作為進(jìn)一步臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)，也成為BMSCs研究的重點(diǎn)。
　　BMSCs在體內(nèi)向膠質(zhì)瘤的遷移過程中，受周圍腦組織微環(huán)境的影響，可能使其分化而影響其對(duì)腫瘤區(qū)域遷移，最后到達(dá)膠質(zhì)瘤部位的有效治療細(xì)胞很少，阻礙其發(fā)揮治療膠質(zhì)瘤的作用。我們考

4、慮通過在體外模擬體內(nèi)的微環(huán)境，讓BMSCs分化為較均一的神經(jīng)細(xì)胞后，再進(jìn)行移植，可能是解決上述問題的有效方法。成神經(jīng)細(xì)胞分化的BMSCs（neurallydifferentiatedbonemarrowmesenchymalstemcells,N-D-BMSCs）可部分模擬顱內(nèi)微環(huán)境中BMSCs分化產(chǎn)生的細(xì)胞，但尚不確定N-D-BMSCs是否對(duì)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生趨向性。如果N-D-BMSCs能夠向膠質(zhì)瘤遷移，其主要的機(jī)制仍待闡明?；谝陨蠁栴}，

5、本論文，在前面學(xué)者研究NSC和BMSCs分化的基礎(chǔ)上，首先，比較了營(yíng)養(yǎng)因子和化學(xué)試劑誘導(dǎo)對(duì)BMSCs在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用差異，并進(jìn)一步探討N-D-BMSCs對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向性研究，以及VEGF、MMP等分子在BMSCs遷移過程中的作用。鑒于以上的思路，我們的研究?jī)?nèi)容如下：
　　第一部分：BMSCs成神經(jīng)細(xì)胞分化
　　目的：觀察兩種新方案在體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的效果。方法：取SD大鼠股骨的骨髓細(xì)

6、胞，利用Percoll法分離BMSCs，并且進(jìn)行培養(yǎng)、純化及鑒定。取第3代細(xì)胞，應(yīng)用兩種不同的方法進(jìn)行誘導(dǎo)。方法一(營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)):含10％胎牛血清的(FBS)的α-MEM、2％B27、20ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）、20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、10ng/ml腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)；方法二(化學(xué)誘導(dǎo))：含10％FBS的α-MEM、2％B27、10μmol/L全反式維甲酸（ATRA）、10mmol/LBt2

7、CAMP，聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞。對(duì)照組用含10％FBS的α-MEM的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)。分化進(jìn)程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察，最后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，對(duì)比分化效果。結(jié)果：兩種方法誘導(dǎo)后，細(xì)胞均出現(xiàn)胞體回縮、突觸伸展，呈現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。免疫熒光染色顯示兩種方法誘導(dǎo)的細(xì)胞不同程度的表達(dá)成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物(NeuN)、
　　神經(jīng)細(xì)胞骨架標(biāo)志物(NF-H)和神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物(Nestin)。方法一中Nestin(16.37±0.31)％的表達(dá)高于

8、方法二中Nestin(10.58±0.16)％的表達(dá)，方法一中NeuN(43.53±1.34)％和NF-H(40.76±0.53)％表達(dá)低于方法二中NeuN(47.63±1.06)％和NF-H(51.39±0.37)％的表達(dá)。結(jié)論：兩種方法均能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞。兩者相比，方法一誘導(dǎo)分化的神經(jīng)前體細(xì)胞較多，更接近顱內(nèi)微環(huán)境；方法二更多的使BMSCs分化為成熟神經(jīng)細(xì)胞。
　　第二部分：N-D-BMSCs對(duì)C

9、6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向性
　　目的：探討N-D-BMSCs在體外和體內(nèi)向C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞趨向性的機(jī)制。方法：在體外實(shí)驗(yàn)，采用Transwell小室共培養(yǎng)系統(tǒng)觀察N-D-BMSCs和C6膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基（C6GCM）共培養(yǎng)，HE染色分析穿過聚醋酸紙膜微孔的細(xì)胞數(shù)量。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過側(cè)腦室注射BrdU標(biāo)記的N-D-BMSCs到大鼠C6膠質(zhì)瘤模型中，免疫組化分析移植細(xì)胞的遷移能力。用ELISA試劑盒檢測(cè)C6GCM中的VEGF的含量。Transw

10、ell小室系統(tǒng)共培養(yǎng)N-D-BMSCs和中和部分VEGF因子的C6GCM共培養(yǎng)，HE染色分析穿過聚醋酸紙膜微孔的細(xì)胞數(shù)量。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSCs培養(yǎng)基中的MMP活性。結(jié)果：在體外實(shí)驗(yàn)表明N-D-BMSCs對(duì)C6膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基有顯著趨向(P<0.01)；體內(nèi)移植結(jié)果顯示BrdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯向腫瘤部位遷移并呈現(xiàn)時(shí)間特異性；C6GCM中含有VEGF；并且VEGF減少的GCM對(duì)N-D-BMSCs吸引減弱。N-D-BMSCs培養(yǎng)基中的含有M