大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化和體內(nèi)移植研究.pdf

1、視網(wǎng)膜變性疾病是嚴(yán)重的致盲眼病，引起視力喪失的主要原因是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的不可逆損傷，目前臨床上還沒有有效的方法能阻止病變進(jìn)展和恢復(fù)視網(wǎng)膜功能。干細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變疾病是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)作為一種多潛能的成體干細(xì)胞，可以直接從病人自體骨髓中獲得，并在體外大量增殖，同時可以避免異體和異種移植無法避免的免疫排斥問題，是目

2、前干細(xì)胞移植研究的焦點。近年研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有跨系統(tǒng)、跨胚層分化的潛能，在不同的誘導(dǎo)劑作用下，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等多種中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞，還可分化為外胚層的神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。因此，BMSCs是未來用于干細(xì)胞移植治療具有臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞。 目前，誘導(dǎo)BMSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的研究剛剛起步，主要集中在以下兩方面：一是采用共培養(yǎng)方法模擬視網(wǎng)膜的局部微環(huán)境進(jìn)行誘導(dǎo)。

3、二是采用細(xì)胞因子進(jìn)行化學(xué)性誘導(dǎo)。鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生大致經(jīng)歷胚胎期和新生期兩個階段。新生階段是鼠視網(wǎng)膜發(fā)育分化的第2個高峰期，存在大量未分化的細(xì)胞，是視桿細(xì)胞分化形成的主要階段，提示新生鼠視網(wǎng)膜微環(huán)境內(nèi)可能存在促進(jìn)干細(xì)胞分化的多種細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分。研究顯示，視網(wǎng)膜干細(xì)胞與新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)后，能較多地分化為視桿細(xì)胞，BMSCs與新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)后可以獲得視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)記物Thy1.1表達(dá)陽性的細(xì)胞，

4、但與新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)是否能誘導(dǎo)BMSCs分化為視桿細(xì)胞和其他視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，目前尚不清楚。在誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的化學(xué)性誘導(dǎo)方法中，bFGF誘導(dǎo)方法是常用的一種經(jīng)典方法，與其他化學(xué)性誘導(dǎo)方法相比，bFGF誘導(dǎo)的優(yōu)點在于可以獲得較高的神經(jīng)細(xì)胞分化率。此外，bFGF聯(lián)合細(xì)胞因子BDNF、NGF可以誘導(dǎo)BMSCs分化為以視桿細(xì)胞為主的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，但bFGF誘導(dǎo)是否直接誘導(dǎo)BMSCs分化為以視桿細(xì)胞為主的多種視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞

5、，共培養(yǎng)微環(huán)境誘導(dǎo)和化學(xué)性誘導(dǎo)對BMSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化效率有何不同，目前未見報道。國內(nèi)外一些學(xué)者將未誘導(dǎo)BMSCs直接移植至視網(wǎng)膜變性大鼠和激光損傷大鼠的視網(wǎng)膜下腔，可以觀察到移植細(xì)胞在視網(wǎng)膜下腔存活、遷移并整合于宿主視網(wǎng)膜，細(xì)胞移植后宿主視網(wǎng)膜功能得到一定的改善，但直接移植的BMSCsi壬移能力都偏低，分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的功能也不強。而BMSCs先進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化后，是否有利于提高其在宿主視網(wǎng)膜內(nèi)存活、遷移和分化的能力，同

6、時更好地改善宿主的視功能，還有待研究。 基于上述的研究現(xiàn)狀，本研究采用新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)和bFGF化學(xué)性誘導(dǎo)兩種方法對BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察并對比兩種方法對誘導(dǎo)后細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞方向分化的不同影響。在此基礎(chǔ)上，將BMSCs經(jīng)體外先行誘導(dǎo)分化后的混合細(xì)胞和未誘導(dǎo)的BMSCs分別移植至變性大鼠的視網(wǎng)膜下腔，觀察并對比兩種策略所移植的細(xì)胞在變性視網(wǎng)膜內(nèi)的存活、遷移和分化，及其挽救變性視網(wǎng)膜的光感受器細(xì)胞的和改善視功能重建

7、情況。本研究分為三個部分： 第一部分：大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及細(xì)胞特性研究 30d齡Long-Evans大鼠股骨來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)，并對其進(jìn)行鑒定和生物學(xué)特性檢測。 成功建立成年Long-Evans大鼠股骨來源BMSCs的培養(yǎng)方法，原代培養(yǎng)細(xì)胞生長良好，7-10天融合成單層。傳代后細(xì)胞呈均一的成纖維細(xì)胞樣，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測純度高達(dá)90％以上，生長良好，可以在體外大量擴增，具有干細(xì)胞的多向分

8、化潛能。 第二部分：大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的體外研究 分別采用Transwell分隔共培養(yǎng)系統(tǒng)和bFGF化學(xué)誘導(dǎo)法對BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察不同誘導(dǎo)方法的誘導(dǎo)效率，以生長培養(yǎng)基DMEM/F12+10％FBS為對照組。結(jié)果顯示： 1.大鼠BMSCs與新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)后，隨著時間延長，神經(jīng)元樣細(xì)胞逐漸增多。誘導(dǎo)后細(xì)胞可表達(dá)成熟神經(jīng)元(MAP-2)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Thy1.1)和視桿細(xì)胞(

9、opsin)的標(biāo)記物，而不表達(dá)雙極細(xì)胞(PKCα)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)標(biāo)記物。誘導(dǎo)后5天MAP-2，Thy1.1陽性率最高，分別為10.8％和3.8％，與其他時間點相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。opsin陽性細(xì)胞出現(xiàn)在誘導(dǎo)后5天，陽性率為1.9％，與誘導(dǎo)后7天相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 2.大鼠BMSCs經(jīng)bFGF誘導(dǎo)后，在1天時絕大多數(shù)細(xì)胞即呈現(xiàn)神經(jīng)元樣改變，但隨著誘導(dǎo)時間延長，神經(jīng)元樣細(xì)胞大量脫

10、落。誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)MAP-2、Thy1.1和lopsin，不表達(dá)PKCα和GFAP。誘導(dǎo)后1天MAP-2，Thy1.1陽性率最高，分別為74.2％和15.6％，與其他時間點相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。opsin表達(dá)陽性的細(xì)胞僅出現(xiàn)在誘導(dǎo)后1天，陽性率為2.3％。 3.對照組BMSCs未發(fā)生形態(tài)變化，MAP-2，Thy1.1，opsin，PKCα和GFAP表達(dá)均為陰性。 4.在誘導(dǎo)的不同時間點，bFGF誘導(dǎo)組M

11、AP-2和Thy1.1的陽性率均顯著高于共培養(yǎng)誘導(dǎo)組(P＜0.01)。bFGF誘導(dǎo)組僅在誘導(dǎo)后1d出現(xiàn)opsin表達(dá)陽性的細(xì)胞，而共培養(yǎng)誘導(dǎo)組在誘導(dǎo)5d時才出現(xiàn)opsin陽性的細(xì)胞。BMSCs經(jīng)bFGF誘導(dǎo)后，隨著誘導(dǎo)時間的延長，多數(shù)細(xì)胞脫落，存留的貼壁細(xì)胞顯著少于共培養(yǎng)誘導(dǎo)組(P＜0.01)。 第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外bFGF誘導(dǎo)后移植至RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后的存活、遷移、分化及其對視功能的改善 將DiI熒光標(biāo)

12、記的未誘導(dǎo)BMSCs和bFGF誘導(dǎo)后1天的混合細(xì)胞(包含BMSCs，已表型分化的神經(jīng)元和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞)分別移植入RCS大鼠的視網(wǎng)膜下腔，以RCS-rdy大鼠作為正常對照，觀察移植后不同時間點，移植細(xì)胞在宿主視網(wǎng)膜下腔存活、遷移和分化情況，以及對變性視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的挽救作用和對視功能的改善。結(jié)果顯示： 1.未誘導(dǎo)的BMSCs和bFGF誘導(dǎo)后的混合細(xì)胞分別移植至RCS大鼠和正常對照大鼠視網(wǎng)膜下腔后，均可至少存活至移植后3個月。

13、兩種細(xì)胞移植后在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存活細(xì)胞數(shù)均顯著多于正常對照大鼠視網(wǎng)膜(P＜0.05)。在移植后3個月，bFGF誘導(dǎo)后的混合細(xì)胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜和正常對照視網(wǎng)膜內(nèi)存活的細(xì)胞多于未誘導(dǎo)BMSCs移植組(P＜0.05，P＜0.01)。 2.未誘導(dǎo)BMSCs直接移植后，在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)3個月遷移至內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，在正常對照大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)主要存在于視網(wǎng)膜下腔，少數(shù)移植細(xì)胞遷移至內(nèi)核層。在移植后1個月和2個月，未誘導(dǎo)BMSCs

14、在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)遷移距離高于正常對照大鼠(P＜0.05，P＜0.01)。bFGF誘導(dǎo)后的混合細(xì)胞移植后，在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)2個月即遷移至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，而在正常對照大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)3個月時偶見移植細(xì)胞遷移至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。在移植后1個月和2個月，bFGF誘導(dǎo)后的混合細(xì)胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)遷移距離高于正常對照大鼠(P＜0.05，P＜0.01)。在移植后不同時間點，bFGF誘導(dǎo)后混合細(xì)胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)遷移距離均顯著高于未誘導(dǎo)BMSCs

15、(P＜0.01)。 3.未誘導(dǎo)的：BMSCs在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)可以表達(dá)Thy1.1，opsin，PKCα和GFAP，在正常對照大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)，僅1個月時表達(dá)GFAP。bFGF誘導(dǎo)后的混合細(xì)胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)，僅在1個月時表達(dá)Thy1.1和GFAP，在正常對照大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)僅在1個月時表達(dá)GFAP。 4.未誘導(dǎo)的BMSCs和bFGF誘導(dǎo)后1天的混合細(xì)胞移植至變性視網(wǎng)膜下腔后均能延緩光感受器細(xì)胞變性，外核層存留的細(xì)胞層數(shù)顯

16、著多于偽手術(shù)組(P＜0.05)。Rod-ERGb波在移植后1個月比偽手術(shù)組潛時縮短，幅值增加(P＜0.05)，Max-ERGb波在移植后1個月和2個月幅值增加(P＜0.05)。而在移植后3個月Rod-ERG和Max-ERGb波潛時和幅值均無明顯改善(P＞0.05)。未誘導(dǎo)的BMSCs和bFGF誘導(dǎo)1天的BMSCs之間對變性視網(wǎng)膜的外核層存留和F-ERG功能改善沒有顯著差別(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.建立了具有高純度和

17、良好生物學(xué)特性的成年Long-Evans大鼠股骨來源BMSCs培養(yǎng)體系，擴展了BMSCs在眼科基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用范圍； 2.新生鼠視網(wǎng)膜和bFGF化學(xué)性誘導(dǎo)均能誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視桿細(xì)胞；新生鼠視網(wǎng)膜微環(huán)境有利于誘導(dǎo)后細(xì)胞存活，但在短時間內(nèi)誘導(dǎo)效率較低。而bFGF化學(xué)性誘導(dǎo)具有短時間內(nèi)誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)元和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的優(yōu)勢，這為未來BMSCs應(yīng)用于臨床進(jìn)行視網(wǎng)膜移植，使患者盡可能在短時