張應力誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化的實驗研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)是一類具有向中胚層、外胚層及內(nèi)胚層多種組織細胞分化能力的原始細胞；在體外、體內(nèi)均可定向分化為成骨細胞和成軟骨細胞；作為這些骨生成細胞的來源細胞，MSCs是骨組織再生的細胞學基礎。基于其多向分化潛能，骨髓MSCs目前己成為組織工程、細胞工程領域最重要的種子細胞，其潛在應用價值越來越受到人們重視；有關骨髓MSCs的基礎和臨床應用研究逐漸成為國際上干細胞領域研究的重點。

2、 骨組織的再生和改建涉及復雜的力學刺激，其中機械力學刺激是其中非常重要的一環(huán)；尤其在牽張成骨(distractionosteogenesis，DO)的骨再生過程中，適宜的機械張應力刺激則顯得尤為重要。在牽張成骨中，新骨形成涉及多種細胞參與，這包括未分化的間充質(zhì)干細胞(MSCs)、成骨細胞(OB)及其前體細胞、成纖維細胞、破骨細胞、內(nèi)皮細胞等；其中MSCs在機械張應力下向牽張區(qū)募集、增殖、及成骨細胞向分化，是新骨形成的細胞學基礎。機械

3、力學刺激是細胞在生物進化過程中受到的最基本的生物刺激之一。適當?shù)臋C械力學刺激可以促進細胞的生長、分化和功能的維持，但過度或持續(xù)時間過長的力學刺激又會對細胞的結構和功能造成損害；因此細胞是如何感受力學刺激信號并將其轉(zhuǎn)化為生物化學信號的，其中涉及哪些信號通路以及相關基因的表達，一直是各國學者不斷探索的前沿課題。近年來，國內(nèi)外學者在成骨細胞對張應力的反應及相關基因表達方面進行了初步的研究，并獲得了可喜的初步成果；然而，牽張成骨中機械張應力是如

4、何誘導MSCs向牽張區(qū)募集、增殖、及成骨細胞向分化，這一過程涉及哪些基因的表達調(diào)控，以及張應力對MSCs的細胞結構和功能產(chǎn)生何種影響，這一系列問題的研究在國際上尚屬空白。 基于上述研究背景，本研究擬對機械張應力下骨髓MSCs細胞結構和功能變化、以及成骨相關基因和凋亡相關基因的表達規(guī)律進行初步的研究探討，以期為MSCs在DO、正畸矯治中作用的分子機制研究提供初步的實驗依據(jù)。 本研究首先通過密度梯度離心法和貼壁法兩種分離方法

5、分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs；并對兩種方法所獲MSCs的細胞純度、增殖活力及成骨特性進行比較；以建立一種較為理想的MSCs體外分離、培養(yǎng)體系。進而，對所獲骨髓MSCs進行骨向、肌向、神經(jīng)向多向分化誘導，以期進一步探索骨髓MSCs的體外生物學特點，證實其多向分化能力，為其在骨組織工程、基因工程以及其他組織器官的修復和再造中的應用提供實驗依據(jù)。在上述前期實驗基礎上，本研究通過采用四點彎曲細胞力學加載裝置，對MSCs施加不同大小的機械力學刺激，并

6、通過SyberGreenReal-timeRT-PCR的方法對成骨相關基因和凋亡相關基因的表達進行檢測，探討了這些基因在MSCs中的表達規(guī)律。為了模擬臨床牽張成骨中牽張器的單次加力狀態(tài)，對MSCs進一步施加單一周期性張應力(2000μstrain，40min)，并對上述成骨基因的表達進行了檢測，以期為單次加力后細胞基因表達規(guī)律的研究及臨床牽張頻率的選擇提供實驗依據(jù)。同時，對MSCs和OB施加4000μstrain的機械超負荷，利用熒光標

7、記技術，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，進一步探討了MSCs和OB對過大機械力學刺激的細胞反應及骨架蛋白F-actin的變化；并采用TUNEL技術對細胞凋亡情況進行了檢測，以更全面地了解MSCs的力學應答過程，為力學刺激下骨組織細胞信號應答網(wǎng)絡的進一步研究，以及臨床頜骨牽張、正畸矯治中選擇最適力提供理論依據(jù)。 結果顯示：1.本實驗改進了大鼠骨髓MSCs體外培養(yǎng)技術，并說明了密度梯度離心法是目前分離純化骨髓MSCs較好的方法。

8、 2.骨髓MSCs在體外誘導劑作用下可成功地分化為成骨樣細胞、神經(jīng)元樣細胞和成肌細胞，說明所獲細胞具有體外多向分化能力；免疫細胞化學檢測表明，所獲細胞呈SH3陽性，進一步說明其為真正的MSCs。 3.MSCs在不同大小機械張應力刺激下，低力值時(400～3000με)成骨相關基因表達增強，高力值時(＞3000με)凋亡相關基因高表達。 4.單一周期性張應力刺激下(2000με)，骨相關因子在MSCs中表達增強，其中多數(shù)