人骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)研究.pdf

1、軟骨缺損的修復(fù)一直是矯形外科的難題。早期開展的微骨折技術(shù)、骨膜軟骨膜移植、軟骨細胞移植等方法都存在諸多問題。上世紀80年代開始，組織工程的發(fā)展和應(yīng)用為軟骨缺損和修復(fù)帶來了新的希望。支架材料、生長因子、種子細胞是組織工程的三要素，隨著制造技術(shù)的進步，支架材料的研究已取得突飛猛進的進展，已有人工骨應(yīng)用于臨床。而目前種子細胞是制約組織工程發(fā)展的瓶頸之一。骨髓間充質(zhì)干細胞因其成體干細胞特征和易獲取性，近年來倍受關(guān)注。但是，骨髓間充質(zhì)干細胞的分離

2、、純化、鑒定以及多向分化條件和機理等目前都不十分清楚。不論是基礎(chǔ)研究還是臨床應(yīng)用，人們都希望獲得穩(wěn)定的、純化的、大量具有骨髓基質(zhì)干細胞生物學表型和功能的種子細胞，以便為基礎(chǔ)研究提供標準的細胞，為臨床應(yīng)用提供細胞庫，真正實現(xiàn)體外構(gòu)建組織器官的目的。為了達到以上目的，最佳途徑就是建立骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞系。 目的： 探索骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)條件。觀察間充質(zhì)干細胞生物學行為和向軟骨誘導(dǎo)分化的能力。以供組織工程基礎(chǔ)研究及骨科臨

3、床應(yīng)用。 方法： 抽取5例健康志愿者骨髓，每例約4ml，利用含Hyclone胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，進行細胞培養(yǎng)并探索條件。取正常骨髓做骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，對該細胞進行流式細胞分析鑒定，根據(jù)臨床研究與應(yīng)用需求誘導(dǎo)分化，配制條件培養(yǎng)液。采用軟骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基加地塞米松、TGF-β1、維生素C，終濃度為，5ug/L 10mmol/L：BMSCs細胞進行軟骨細胞誘導(dǎo)6，12，18，24d

4、，相差顯微鏡觀察，HE染色觀察細胞形態(tài)；免疫細胞化學染色觀察軟骨細胞誘導(dǎo)II型膠原的表達，原位雜交觀察軟骨細胞誘導(dǎo)II型膠原mRNA表達結(jié)果：10％的血清最有利于細胞生長，Percoll細胞分離液分離細胞可以得到更純化的細胞，細胞首次換液時間為6天。對傳代培養(yǎng)細胞進行流式細胞分析鑒定，細胞表達CD29，CD71，CD106，不表達CD34，CD45，表明培養(yǎng)細胞是間充質(zhì)干細胞。hBMSC細胞可以條件誘導(dǎo)為軟骨，具有成體干細胞的特征。