Wntll調控大鼠骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化過程的機理研究.pdf

1、前言
　　由關節(jié)炎和創(chuàng)傷等原因造成的軟骨缺損及功能障礙是臨床上面臨的難題之一[1]。利用軟骨組織工程的方法再造軟骨治療軟骨損傷，在臨床上具有良好的應用前景[2]。臨床中，如何能盡快地形成新的骨組織至關重要，不僅可以縮短骨折愈合的時間，也為盡快地恢復骨的功能打下了堅實的基礎。因此，要首先了解軟骨細胞形成的相關機制，以及影響軟骨細胞形成的相關因子和信號通路。
　　骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalste

2、mcells，BMSCs)是一類具有潛在多分化能力的成體干細胞，可以在體內及體外誘導分化為成骨細胞和軟骨細胞等不同類型細胞[3,4]。此外，BMSCs具有極強的自我修復能力，獲取簡單、增殖力強、來源廣泛、免疫原性弱[5]、自體移植不發(fā)生排斥反應[6]、不涉及倫理等特點，成為組織細胞工程研究的熱點。
　　Wnt蛋白是一類高度保守的分泌型糖蛋白，其作為信號因子參與了包括生長、發(fā)育和凋亡在內的眾多進程[7]。Wnt通過作用于細胞膜上的受

3、體，進一步激活細胞內的信號轉導系統(tǒng)，從而調節(jié)相關靶基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路受體LRP5發(fā)生功能缺失突變后會造成骨質疏松的表型，表明Wnt信號通路在骨形成過程中起重要作用[8]。有研究表明，在小鼠肢體發(fā)育及軟骨分化過程中檢測到了多種Wnt基因的表達[9]。Wnt3a可以促進人間充質干細胞增殖并抑制其分化為成骨細胞及軟骨細胞[10,11]。Wnt5a調控軟骨細胞的形成，Wnt5b抑制軟骨細胞的分化[12，13]。在間質凝結(mes

4、enchymalcondensations)中過表達Wnt1，Wnt7a或者Wnt14會抑制其分化為軟骨細胞[14-16]。上述研究表明Wnt信號通路可能在調控間充質干細胞分化方面起重要作用。最近有報道發(fā)現(xiàn)Wnt11可以在軟骨細胞中誘導Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡcollagen)的表達[17]。Ⅱ型膠原蛋白表達量的增加是間充質干細胞向軟骨細胞分化的標志事件之一，這表明Wnt11可能在調控間充質干細胞向軟骨細胞分化過程中起重要作用。此外，X

5、u等人的研究發(fā)現(xiàn)在三維藻朊酸鹽凝膠上誘導人間充質干細胞向軟骨細胞分化的過程中Wnt11基因在誘導分化的中后期階段高表達[18]。
　　生長因子在BMSCs定向分化為軟骨細胞的過程中起到了非常關鍵的作用，已有學者研究得出，TGF-β1能夠誘導BMSCs向軟骨細胞分化[19,20]。TGF-β1在誘導BMSCs轉化為軟骨細胞的過程中，對軟骨細胞的分化和功能具有雙向調節(jié)作用，可以促進未分化或分化早期的軟骨細胞DNA合成、增殖、分化及細胞

6、外基質的合成，抑制成熟軟骨細胞的增殖和分化。這種雙向調節(jié)作用與TGF-β1的濃度密切相關，有研究表明[21,22]，不同濃度的TGF-β1可能通過影響B(tài)MP-2，進而影響B(tài)MSCs向軟骨細胞的分化，濃度過低，不足以引發(fā)BMP-2的表達，不能誘導軟骨的形成，濃度過高，則導致BMSCs向軟骨細胞分化的潛能下降，不利于誘導分化。
　　JNK通路是MAPK通路家族的三大主要成員之一，目前已發(fā)現(xiàn)三種，分別由三個基因編碼，JNK1、JNK2、

7、JNK3。該途徑的特點之一是可被多種應激因素激活，，也可被多種類型的細胞表面受體激活。相對于ERK途徑，就目前的研究，對JNK途徑在MSCs分化中的作用及其在軟骨細胞增殖和分化過程中的作用還不是十分明確。有學者經(jīng)研究得出IL-17通過JNK途徑誘導MMP13和aggrecanase的表達從而引起關節(jié)軟骨細胞基質的降解[23]。
　　蛋白激酶C(PKC)屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛分布于機體各器官、組織和細胞中，是肌醇磷脂信號

8、通路的中心環(huán)節(jié)。DelCarol[24]等研究認為激活PKCβ1通路，結果導致軟骨細胞死亡，若添加特異性PKCβ1抑制劑，可完全抑制軟骨細胞死亡。Ciarmatori[25]等研究認為，PKC信號通路與多種信號通路一起參與了誘導軟骨細胞的增殖和早期分化過程。以上的研究表明，PKC作為重要的信號因子，參與調解軟骨細胞生長、增殖、分化等多種生物學效應，但尚缺乏具體機制。
　　本研究擬采用大鼠骨髓間充質干細胞為研究對象，通過慢病毒介導的

9、轉基因技術，將Wnt11轉染入骨髓間充質干細胞，結合體外誘導軟骨形成等實驗，在TGF-β1存在的條件下，加入或不加入JNK和PKC抑制劑，探討TGF-β1在骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化過程中的協(xié)同作用。
　　材料和方法
　　一、實驗材料
　　1、主要試劑
　　DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）
　　PBS（Hyclone，美國）
　　FBS（Hyclone，美國）
　　胰酶（Hyclone，美

10、國）
　　HISTOPAQUE-1083（Sigma，美國）
　　MTT（Sigma，美國）
　　DMSO（Sigma，美國）
　　細胞周期檢測試劑盒（Hyclone，美國）
　　Polybrene（Sigma，美國）
　　引物（生工，中國）
　　PCR試劑盒（Hyclone，美國）
　　多聚甲醛（Hyclone，美國）
　　Cy3標記山羊抗兔（Hyclone，美國）
　　tr

11、itonX100（Hyclone，美國）
　　山羊血清（Hyclone，美國）
　　DAPI（Sigma，美國）
　　Wnt11（Santa，美國）
　　COL2A1（Santa，美國）
　　Wnt11抗體（Santa，美國）
　?、蛐湍z原多克隆抗體（Santa，美國）
　　Aggrecan抗體（Santa，美國）
　　BCA蛋白濃度測定試劑盒（Hyclone，美國）
　　預染蛋白分

12、子量標準（Fermentas，加拿大）
　　TGF-β1（Hyclone，美國）
　　JNK抑制劑（Hyclone，美國）
　　PKC抑制劑（Hyclone，美國）
　　成軟骨誘導液（Hyclone，美國）
　　阿爾新藍（Hyclone，美國）
　　2、主要儀器
　　倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日本）
　　CO2培養(yǎng)箱（力申，中國）
　　超凈工作臺（安泰，中國）
　　流式細

13、胞儀（BD，美國）
　　酶標儀（BIOTEK，美國）
　　紫外分光光度計（Thermo，美國）
　　熒光定量PCR儀（Thermo，美國）
　　激光共聚焦掃描顯微鏡（OLYMPUS，日本）
　　雙垂直蛋白電泳儀（BD，美國）
　　凝膠成像系統(tǒng)（Thermo，美國）
　　二、實驗方法
　　1、SD大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　采用密度梯度離心法從大鼠后臀的脛骨和股骨骨髓腔

14、中分離出骨髓間充質干細胞，采用流式細胞術對分離的骨髓間充質干細胞表面的CD34，CD45，CD44和CD29等進行鑒定。
　　2、構建Wnt11慢病毒表達載體，轉染骨髓間充質干細胞
　　細胞分為Wnt11+eGFP基因轉染組，慢病毒空載體轉染組，未轉染對照組，以熒光顯微鏡檢測轉染效率及細胞生長情況。
　　3、檢測細胞的Wnt11表達水平
　　在2中的三組細胞中加入Wnt11抗體，分別以免疫熒光法、實時定量PCR法

15、和westernblot法檢測2中細胞的Wnt11表達水平。
　　4、檢測細胞的增殖情況
　　利用MTT法檢測2中的三組細胞的增殖情況。
　　5、檢測Aggrecan和CollagenⅡ的表達水平
　　在2中的三組骨髓間充質干細胞中加入軟骨細胞標志基因Aggrecan和CollagenⅡ抗體，分別以實時定量PCR法和westernblot法檢測Aggrecan和CollagenⅡ的表達水平，再利用免疫組化檢測上述

16、三組細胞中CollagenⅡ的表達情況。
　　6、TGF-β1對體外誘導軟骨形成實驗的研究
　　將2中的三組細胞分別在加入或不加入TGF-β1情況下進行體外誘導軟骨形成實驗，進行阿爾新藍染色，并測定OD590處的吸光值;利用實時定量PCR檢測Aggrecan，CollagenⅡ及軟骨形成調控基因Sox9，RUNX2和Ihh的表達水平。
　　7、抑制劑對體外誘導軟骨形成實驗的研究
　　TGF-β1存在的情況下，在培

17、養(yǎng)基中分別加入JNK抑制劑SP600125和PKC抑制劑GF109203X，進行體外誘導軟骨形成實驗。實時定量PCR檢測三組骨髓間充質干細胞分化形成的軟骨細胞中Aggrecan和CollagenⅡ表達量的變化情況。
　　結果
　　1、SD大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　流式細胞儀檢測得出CD34、CD45、CD44、CD29的陽性表達率分別為3.25％、4.25％、95.73％、93.71％，證實所分離培養(yǎng)

18、的細胞為骨髓間充質干細胞。
　　2、Wnt11慢病毒表達載體轉染BMSC后細胞生長良好，轉染效率提高
　　Wnt11慢病毒表達載體轉染的BMSC中，熒光顯微鏡下觀察得出細胞生長良好，轉染效率提高。
　　3、Wnt11慢病毒表達載體轉染BMSC后，Wnt11表達上調
　　Wnt11慢病毒表達載體轉染的BMSC中，免疫熒光法、實時定量PCR法和westernblot法檢測得出Wnt11的表達上調，明顯高于慢病毒空載體

19、轉染組和未轉染對照組。
　　4、Wnt11慢病毒表達載體轉染BMSC后抑制細胞的增殖
　　三組細胞均在第四天增殖能力達到峰值，Wnt11+eGFP基因轉染組的BMSC的OD值小于其他兩組，說明通過Wnt11慢病毒轉染抑制了BMSC的增殖。
　　5、Wnt11慢病毒表達載體轉染BMSC后，Aggrecan和CollagenⅡ表達水平上調
　　在加入軟骨細胞標志基因Aggrecan和CollagenⅡ抗體后，實時定量

20、PCR法和westernblot法檢測得出，基因轉染組BMSC的Aggrecan和CollagenⅡ表達水平上調，其他兩組無明顯差異。另外，免疫組化檢測得出基因轉染組BMSC的CollagenⅡ呈陽性表達，細胞質呈棕黃色，其他兩組無明顯變化。
　　6、TGF-β1可以促進BMSC體外誘導軟骨形成
　　三組BMSC在加入TGF-β1的情況下，經(jīng)阿爾新藍染色得出，OD590的值要明顯高于未加入TGF-β1的BMSC。Real-t

21、imePCR檢測得出，加入TGF-β1的情況下，Aggrecan、CollagenⅡ及軟骨形成調控基因Sox9，、RUNX2和Ihh的表達上調，明顯高于未加入TGF-β1的BMSC。
　　7、JNK和PKC抑制劑可以抑制BMSC體外誘導軟骨形成
　　在TGF-β1存在的情況下，經(jīng)Real-timePCR檢測得出，加入JNK抑制劑SP600125和PKC抑制劑GF109203X的BMSC，Aggrecan、CollagenⅡ的

22、表達下調，明顯低于未加入抑制劑組BMSC。
　　結論
　　1、BMSC經(jīng)Wnt11慢病毒載體轉染后，抑制BMSC的增殖，Aggrecan和CollagenⅡ的表達水平上調，可以進行后續(xù)實驗研究。
　　2、在經(jīng)Wnt11慢病毒載體轉染后的BMSC中加入TGF-β1，可以使軟骨標志性基因Aggrecan、CollagenⅡ及軟骨形成調控基因Sox9，、RUNX2和Ihh的表達上調，促進BMSC體外誘導軟骨形成。