EMILIN3基因促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向軟骨細(xì)胞分化.pdf

1、研究背景:
　　關(guān)節(jié)軟骨缺損后其自身修復(fù)能力有限,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能上不可逆的損害。目前,臨床中治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法有骨髓刺激修復(fù)和軟骨移植修復(fù),前者療效隨時(shí)間逐漸下降;后者材料來源受限,且異體組織具有免疫原性。隨著生物醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展,自體軟骨細(xì)胞因其功能相同、無免疫排斥反應(yīng),被用作組織工程軟骨的種子細(xì)胞。但軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增能力有限,且取材局限較大。而間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能,來源廣泛,其中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力強(qiáng),可在體外

2、大規(guī)模擴(kuò)增而不丟失多向分化潛能,并且異體移植排斥反應(yīng)小,有望成為組織工程軟骨理想的種子細(xì)胞。
　　hBMSCs向軟骨細(xì)胞的分化需要特定的誘導(dǎo)環(huán)境,特別是需要一定的生長因子保證其遷移、增殖、存活及向軟骨的分化潛能。目前,研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分信號分子具有調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移、增殖(PDGF-B,FGF-2)和軟骨分化(TGF-β1,TGF-β3,IGF-I)的作用。EMILIN3是EMILIN基因家族(EMILIN1、EMILIN2

3、、EMILIN3)的成員,在NH2末端有半胱氨酸彈性蛋白微纖維富集區(qū)。研究發(fā)現(xiàn):EMILIN3在軟骨膜和發(fā)育的骨骼周圍高表達(dá),但是在成熟的成骨細(xì)胞幾乎檢測不到它的表達(dá);在體外培養(yǎng)的人hMSCs向軟骨誘導(dǎo)過程中,隨著時(shí)間的延長EMILIN3表達(dá)增加,推測此基因在骨骼的中可能發(fā)揮著重要的作用。因此,本研究擬通過檢測EMILIN3對hBMSCs增殖及向軟骨分化的影響,為軟骨修復(fù)提供新的依據(jù)。
　　研究目的:
　　1.通過構(gòu)建EMI

4、LIN3腺病毒表達(dá)載體感染hBMSCs,研究EMILIN3過表達(dá)對hBMSCs增殖的影響。
　　2.研究EMILIN3過表達(dá)對hBMSCs向軟骨分化細(xì)胞分化的影響,以期為軟骨修復(fù)提供新的依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.采用密度梯度離心法分離、純化。
　　2.利用PCR方法擴(kuò)增人EMILIN3基因,通過同源重組將目的基因插入腺病毒表達(dá)質(zhì)粒,通過PCR進(jìn)行陽性克隆鑒定,測序,利用Western blot檢測EMILI

5、N3蛋白表達(dá)。在大腸桿菌中擴(kuò)增陽性質(zhì)粒和腺病毒輔助質(zhì)粒,然后在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。通過CsCl密度梯度離心進(jìn)行病毒的分離、純化,然后感染393T細(xì)胞測定病毒的滴度。
　　3.將hBMSCs培養(yǎng)于96孔板,分別以10、50、100MOI病毒感染hBMSCs細(xì)胞,48h后普通熒光顯微鏡觀察感染效果,選擇感染效果最好的MOI進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　4.利用MTT方法檢測EMILIN3蛋白表達(dá)對細(xì)胞的增殖情況。
　　5.用

6、實(shí)時(shí)定量PCR法檢測EMILIN3蛋白表達(dá)對hBMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后CollagenII、Aggrecan、SOX9的基因表達(dá)水平。
　　6.Western bloting檢測EMILIN3蛋白表達(dá)對hBMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后CollagenII、Aggrecan、SOX9的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過密度梯度離心法獲得的hBMSCs細(xì)胞純度較高。
　　2.利用PCR方法擴(kuò)增EMILIN3基因得

7、到2336bp片段,與預(yù)期大小相符。通過克隆鑒定和測序證明插入到腺病毒表達(dá)載體中的EMILIN3基因序列完全正確。Western blot檢測EMILIN3表達(dá)質(zhì)粒在100KD左右有陽性條帶,其大小和EMILIN3-GFP-Flag融合蛋白(114KD)相符。利用試劑盒測得對照腺病毒的滴度是5×1010IFU/ml,EMILIN3病毒的滴度是1.4×1011IFU/ml。
　　3.熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)腺病毒在MOI=100時(shí)感染hBM

8、SCs的效果最好。
　　4.EMILIN3病毒感染hBMSCs后通過MTT實(shí)驗(yàn)顯示:hBMSCs+對照腺病毒組細(xì)胞和hBMSCs組細(xì)胞相比增殖能力降低,但在所有的檢測點(diǎn)均沒有差異;在第1,2天,hBMSCs+EMILIN3腺病毒組細(xì)胞與hBMSCs+對照腺病毒組細(xì)胞、hBMSCs組細(xì)胞相比均沒有差異。在第3,4,5和6天,hBMSCs+EMILIN3腺病毒組細(xì)胞OD值與hBMSCs+對照腺病毒組細(xì)胞相比均有差異(p<0.05)。在

9、第4,5和6天,hBMSCs+EMILIN3腺病毒組細(xì)胞OD值與MSCs組細(xì)胞相比均有差異(p<0.05)。
　　5.經(jīng)過前期成軟骨誘導(dǎo)后,各組細(xì)胞能檢測到CollagenII、Aggrecan、SOX9mRNA的表達(dá),說明誘導(dǎo)成功。EMILIN3過表達(dá)組細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后與對照病毒細(xì)胞組相比CollagenII、Aggrecan、SOX9mRNA表達(dá)分別增加2.5倍、2.7倍、2.1倍,且差異顯著,對照病毒細(xì)胞組和純細(xì)胞組相比

10、沒有明顯差異。
　　6.經(jīng)過前期成軟骨誘導(dǎo)后,各組細(xì)胞能檢測到CollagenII、Aggrecan、SOX9蛋白的表達(dá),說明誘導(dǎo)成功。EMILIN3過表達(dá)組細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后與對照病毒細(xì)胞組相比CollagenII、Aggrecan、SOX9蛋白相對表達(dá)分別增加0.75倍、0.74倍、0.40倍,且差異顯著,對照病毒細(xì)胞組和純細(xì)胞組相比沒有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.通過密度梯度離心貼壁培養(yǎng)法分離出的hBMSC