類風濕關節(jié)炎患者骨髓間充質干細胞增殖能力及向軟骨細胞分化能力的研究.pdf

1、目的： 通過比較類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者與正常人骨髓間充質干細胞(bone marrow—derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖能力及向軟骨分化的能力，探討RA患者BMSCs是否存在缺陷或變異，能否用于自體移植，抑或RA本身就是一種干細胞病，與RA的發(fā)病相關。 方法： 1．BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定：實驗分為RA患者組與正常對照

2、組，分別采集8例RA患者與8例健康志愿者骨髓各5ml，用密度梯度離心及貼壁法對細胞進行分離、培養(yǎng)、傳代，流式細胞術鑒定P3代BMSCs的表面標志。 2．BMSCs的增殖能力測定：MTT法測定P3、P6代BMSCs生長曲線，計算細胞群體倍增時間；流式細胞術測定細胞周期，計算增殖指數(shù)；實時熒光定量PCR(real time polymerase chain reaction，RT—PCR)測定端粒酶逆轉錄酶(humantelomer

3、ase reverse transcriptase，hTERT)的表達。 3．BMSCs在體外軟骨誘導培養(yǎng)液中向軟骨細胞分化：將P3代BMSCs置于含10ng/ml的rhTGF—β1，丙酮酸鈉1mmol/L，地塞米松10-7mol/L，牛胰島素6.25μg/ml，Vc0.5ul/ml，5％胎牛血清軟骨細胞誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)，7天、14天時在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況及形態(tài)，14天時用甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖的分泌，免疫組化法檢測

4、Ⅱ型膠原的分泌，以L—DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)的正常人BMSCs為陰性對照。 結果： 1．正常對照組BMSCs在P3代時細胞形態(tài)均一，長梭形或多角形，呈平行、旋渦狀、輻射狀排列。經(jīng)流式細胞儀檢測，CD34、CD45陰性，CD44、CD71陽性，證明獲得細胞為間充質干細胞。RA患者BMSCs在形態(tài)學上與正常對照組無明顯差異。 2．BMSCs增殖能力測定： 2.1正常對照組P3代時細胞群體倍增時間為4.73±

5、0.31天，RA組為4.80±0.33天，兩組差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05；P6代時正常對照組細胞群體倍增時間為5.74±0.35天，RA組為6.33±0.34天，RA組BMSCs群體倍增時間長于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.001。 2.2正常對照組P3代BMSCs增殖指數(shù)為17.87±2.05％，RA組為16.86±2.09％，兩組差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05；P6代正常對照組BMSCs增殖指數(shù)為10.73±1.7

6、8％，RA組為6.17±2.17％，RA組增殖指數(shù)小于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01。2.3正常對照組P6代MSCs hTERT表達量為10.63±1.49，RA組為3.08±1.01，RA患者hTERT表達水平較正常對照組低，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01。 3．正常對照組MSCs在軟骨細胞誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天后甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化均為陽性，證實BMSCs成功誘導為類軟骨細胞。同樣RA組亦可誘導為類軟骨

7、細胞。 結論： 1．兩組人群均可成功分離、培養(yǎng)得到BMSCs，且RA患者與正常對照組細胞形態(tài)無明顯差異。 2．兩組人群P3代BMSCs細胞增殖能力的差異無統(tǒng)計學意義，但在P6代時RA患者BMSCs的增殖滯后于正常組，推斷RA患者BMSCs較正常人衰老速度加快；hTERT測定顯示RA組BMSCs的hTERT表達量低于正常對照組，說明這種提前老化可能與hTERT的表達過低有關，hTERT表達減少后不能維持端粒長度，細