類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力及向軟骨細(xì)胞分化能力的研究.pdf

1、目的： 通過比較類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者與正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow—derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖能力及向軟骨分化的能力，探討RA患者BMSCs是否存在缺陷或變異，能否用于自體移植，抑或RA本身就是一種干細(xì)胞病，與RA的發(fā)病相關(guān)。 方法： 1．BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定：實(shí)驗(yàn)分為RA患者組與正常對(duì)照

2、組，分別采集8例RA患者與8例健康志愿者骨髓各5ml，用密度梯度離心及貼壁法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)、傳代，流式細(xì)胞術(shù)鑒定P3代BMSCs的表面標(biāo)志。 2．BMSCs的增殖能力測定：MTT法測定P3、P6代BMSCs生長曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間；流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期，計(jì)算增殖指數(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time polymerase chain reaction，RT—PCR)測定端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomer

3、ase reverse transcriptase，hTERT)的表達(dá)。 3．BMSCs在體外軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中向軟骨細(xì)胞分化：將P3代BMSCs置于含10ng/ml的rhTGF—β1，丙酮酸鈉1mmol/L，地塞米松10-7mol/L，牛胰島素6.25μg/ml，Vc0.5ul/ml，5％胎牛血清軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，7天、14天時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況及形態(tài)，14天時(shí)用甲苯胺藍(lán)染色檢測蛋白多糖的分泌，免疫組化法檢測

4、Ⅱ型膠原的分泌，以L—DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)的正常人BMSCs為陰性對(duì)照。 結(jié)果： 1．正常對(duì)照組BMSCs在P3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)均一，長梭形或多角形，呈平行、旋渦狀、輻射狀排列。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，CD34、CD45陰性，CD44、CD71陽性，證明獲得細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。RA患者BMSCs在形態(tài)學(xué)上與正常對(duì)照組無明顯差異。 2．BMSCs增殖能力測定： 2.1正常對(duì)照組P3代時(shí)細(xì)胞群體倍增時(shí)間為4.73±

5、0.31天，RA組為4.80±0.33天，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05；P6代時(shí)正常對(duì)照組細(xì)胞群體倍增時(shí)間為5.74±0.35天，RA組為6.33±0.34天，RA組BMSCs群體倍增時(shí)間長于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001。 2.2正常對(duì)照組P3代BMSCs增殖指數(shù)為17.87±2.05％，RA組為16.86±2.09％，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05；P6代正常對(duì)照組BMSCs增殖指數(shù)為10.73±1.7

6、8％，RA組為6.17±2.17％，RA組增殖指數(shù)小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。2.3正常對(duì)照組P6代MSCs hTERT表達(dá)量為10.63±1.49，RA組為3.08±1.01，RA患者h(yuǎn)TERT表達(dá)水平較正常對(duì)照組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。 3．正常對(duì)照組MSCs在軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天后甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化均為陽性，證實(shí)BMSCs成功誘導(dǎo)為類軟骨細(xì)胞。同樣RA組亦可誘導(dǎo)為類軟骨

7、細(xì)胞。 結(jié)論： 1．兩組人群均可成功分離、培養(yǎng)得到BMSCs，且RA患者與正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。 2．兩組人群P3代BMSCs細(xì)胞增殖能力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在P6代時(shí)RA患者BMSCs的增殖滯后于正常組，推斷RA患者BMSCs較正常人衰老速度加快；hTERT測定顯示RA組BMSCs的hTERT表達(dá)量低于正常對(duì)照組，說明這種提前老化可能與hTERT的表達(dá)過低有關(guān)，hTERT表達(dá)減少后不能維持端粒長度，細(xì)