慢病毒介導(dǎo)Pannexin3基因促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化.pdf

1、目的：通過對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stem Cells, BMSCs)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染Pannexin3基因進(jìn)而研究Pannexin3對(duì)成軟骨分化的影響。
　　方法:通過提取大鼠股骨、脛骨骨髓，用貼壁培養(yǎng)法體外培養(yǎng)大鼠BMSCs，傳至第三代，對(duì)其進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，Western Blot檢測(cè)0d.3d.7d.14d.21d Pannexin3表達(dá)情況。再次體外培養(yǎng)大鼠BMSCs，傳至第三代，并按照以下情況分組：

2、空白對(duì)照組：不作處理；空載體(Mock)轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染帶有Mock陰性基因的慢病毒；Pannexin3轉(zhuǎn)染（Panx3）組：轉(zhuǎn)染攜帶Pannexin3基因的慢病毒；轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡觀察Panx3組和Mock組的熒光表達(dá)，并評(píng)估轉(zhuǎn)染效率；三組均用成軟骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的BMSCs和誘導(dǎo)后各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；MTT法繪制各組細(xì)胞誘導(dǎo)后0h.24h.48h.72h時(shí)生長(zhǎng)曲線；培養(yǎng)至第14天，予以甲苯胺藍(lán)染色

3、對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定；RT-PCR檢測(cè)軟骨特異性標(biāo)記物II型膠原（Collagen-type II, COL II）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan） mRNA的表達(dá)；Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞Pannexin3及β-catenin的表達(dá)情況；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±S)表示,應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間及兩兩參數(shù)比較用單因素方差分析，方差整齊時(shí)兩兩比較行 LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)行 Tamhane檢

4、驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs體外培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況：靜置培養(yǎng)48h后有少量細(xì)胞貼壁，96h后可見細(xì)胞部分細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，并呈由中央向四周放射，第三代BMSCs培養(yǎng)至第4天可鋪滿90％左右，呈螺旋狀排列，細(xì)胞形態(tài)均勻，呈長(zhǎng)梭形；2. Western Blot結(jié)果顯示大鼠BMSCs成軟骨誘導(dǎo)過程中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，Pannexin3表達(dá)量逐漸上升，于14天達(dá)高峰，21天表達(dá)下調(diào)；

5、3.倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs成軟骨誘導(dǎo)后的形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況：于誘導(dǎo)后48h可見所有細(xì)胞存在收縮現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量不變，細(xì)胞長(zhǎng)度變短，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，培養(yǎng)板中所有細(xì)胞逐漸收縮變?yōu)闄E圓形，部分細(xì)胞脫壁死亡，剩余細(xì)胞存在明顯聚集現(xiàn)象；4.熒光顯微鏡下觀察Panx3組及Mock組轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)出顯著的綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率約為85%；5. MTT結(jié)果顯示隨著時(shí)間的增加，三組細(xì)胞均有增殖，24h時(shí)Panx3組BMSCs吸光值即小于對(duì)照組及Mock組

6、(P<0.05)，48h及72h時(shí)Panx3組吸光值明顯小于對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；6.在三組BMSCs成軟骨誘導(dǎo)14d后，對(duì)照組、Mock組、Panx3組甲苯胺藍(lán)染色均呈現(xiàn)陽(yáng)性；7.RT-PCR顯示成軟骨誘導(dǎo)后14d Panx3組軟骨特異性標(biāo)記物II型膠原（Collagen-type II, COL II）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA的表達(dá)較對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組高（P<0.05）；8. Western Bl

7、ot顯示成軟骨誘導(dǎo)后14天Panx3組Pannexin3的表達(dá)高于對(duì)照組及Mock組（P<0.05），而β-catenin表達(dá)明顯低于另外兩組（P<0.05）。
　　結(jié)論：1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化過程中，Pannexin3的表達(dá)在3d時(shí)即有增加，7d時(shí)即有明顯增加，14d時(shí)達(dá)高峰， Pannexin3在BMSCs成軟骨分化中起重要作用；2.攜帶Pannexin3基因的慢病毒在成功感染BMSCs后對(duì)細(xì)胞的增殖起到了抑制作用