慢病毒介導Pannexin3基因促進大鼠骨髓間充質干細胞成軟骨分化.pdf

1、目的：通過對大鼠骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Stem Cells, BMSCs)進行慢病毒轉染Pannexin3基因進而研究Pannexin3對成軟骨分化的影響。
　　方法:通過提取大鼠股骨、脛骨骨髓，用貼壁培養(yǎng)法體外培養(yǎng)大鼠BMSCs，傳至第三代，對其進行成軟骨誘導，Western Blot檢測0d.3d.7d.14d.21d Pannexin3表達情況。再次體外培養(yǎng)大鼠BMSCs，傳至第三代，并按照以下情況分組：

2、空白對照組：不作處理；空載體(Mock)轉染組：轉染帶有Mock陰性基因的慢病毒；Pannexin3轉染（Panx3）組：轉染攜帶Pannexin3基因的慢病毒；轉染48h后熒光顯微鏡觀察Panx3組和Mock組的熒光表達，并評估轉染效率；三組均用成軟骨誘導液進行誘導培養(yǎng)；倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的BMSCs和誘導后各組細胞的生長情況；MTT法繪制各組細胞誘導后0h.24h.48h.72h時生長曲線；培養(yǎng)至第14天，予以甲苯胺藍染色

3、對誘導后的細胞進行鑒定；RT-PCR檢測軟骨特異性標記物II型膠原（Collagen-type II, COL II）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan） mRNA的表達；Western Blot檢測各組細胞Pannexin3及β-catenin的表達情況；實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差( x±S)表示,應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間及兩兩參數(shù)比較用單因素方差分析，方差整齊時兩兩比較行 LSD檢驗，方差不齊時行 Tamhane檢

4、驗，當P<0.05時認為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：1.倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs體外培養(yǎng)生長狀況：靜置培養(yǎng)48h后有少量細胞貼壁，96h后可見細胞部分細胞形態(tài)為長梭形，并呈由中央向四周放射，第三代BMSCs培養(yǎng)至第4天可鋪滿90％左右，呈螺旋狀排列，細胞形態(tài)均勻，呈長梭形；2. Western Blot結果顯示大鼠BMSCs成軟骨誘導過程中，隨著誘導時間的增加，Pannexin3表達量逐漸上升，于14天達高峰，21天表達下調；

5、3.倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs成軟骨誘導后的形態(tài)變化及生長情況：于誘導后48h可見所有細胞存在收縮現(xiàn)象，細胞數(shù)量不變，細胞長度變短，隨著誘導時間的增加，培養(yǎng)板中所有細胞逐漸收縮變?yōu)闄E圓形，部分細胞脫壁死亡，剩余細胞存在明顯聚集現(xiàn)象；4.熒光顯微鏡下觀察Panx3組及Mock組轉染呈現(xiàn)出顯著的綠色熒光，轉染效率約為85%；5. MTT結果顯示隨著時間的增加，三組細胞均有增殖，24h時Panx3組BMSCs吸光值即小于對照組及Mock組

6、(P<0.05)，48h及72h時Panx3組吸光值明顯小于對照組及空載體轉染組(P<0.05)；6.在三組BMSCs成軟骨誘導14d后，對照組、Mock組、Panx3組甲苯胺藍染色均呈現(xiàn)陽性；7.RT-PCR顯示成軟骨誘導后14d Panx3組軟骨特異性標記物II型膠原（Collagen-type II, COL II）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA的表達較對照組及空載體轉染組高（P<0.05）；8. Western Bl

7、ot顯示成軟骨誘導后14天Panx3組Pannexin3的表達高于對照組及Mock組（P<0.05），而β-catenin表達明顯低于另外兩組（P<0.05）。
　　結論：1.大鼠骨髓間充質干細胞成軟骨分化過程中，Pannexin3的表達在3d時即有增加，7d時即有明顯增加，14d時達高峰， Pannexin3在BMSCs成軟骨分化中起重要作用；2.攜帶Pannexin3基因的慢病毒在成功感染BMSCs后對細胞的增殖起到了抑制作用