慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾Smad6基因促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：大塊骨缺損的修復(fù)是骨科醫(yī)生最常見的遇見的臨床問題。近年來，組織工程技術(shù)的發(fā)展日趨成熟，使骨缺損的修復(fù)成為可能。理想的組織工程化骨必需具備以下三要素：種子細(xì)胞、細(xì)胞因子和支架材料。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，它在不同的誘導(dǎo)條件下可定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。又由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相對容易獲得，體外培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)相對較成熟，故而成為骨組織工程中最常用的種子細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過程中受

2、到多條信號通路的調(diào)節(jié)，其中BMP信號通路也是研究最多、最早的一條信號通路。BMPs可通過激活細(xì)胞表面的BMP受體來發(fā)揮作用，BMPR受體激活后主要通過多種Smads蛋白在細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)效應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的Smad家族成員至少包括九種蛋白，按功能可分為受體調(diào)節(jié)Smads(R－Smads，Smad1、2、3、5、8、9)、共同調(diào)節(jié)Smads(Co－Smads，Smad4)、和抑制性Smads(I－Smads，Smad6、7)。其中I-Smads如S

3、mad6和Smad7對BMP/TGF-β信號通路起著負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。研究表明，Smad6和Smad7對TGF-β和BMP信號通路的阻斷作用具有選擇性：Smad7對TGF-β和BMP通路均有阻斷作用，而Smad6似乎只對BMP信號通路起阻斷作用。因此，我們認(rèn)為內(nèi)源性的Smad6在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過程中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。
　　 目的：針對大鼠Smad6基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建并篩選出有效的慢病毒干擾載體；體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)

4、干細(xì)胞并轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體，觀察感染后細(xì)胞Smad6基因和蛋白的干擾效率，同時(shí)觀察Smad6基因抑制后對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；觀察Smad6基因抑制后對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的影響；評價(jià)Smad6基因干擾后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化骨對大鼠橈骨干缺損的修復(fù)效果。
　　 方法：(1)Smad6基因干擾慢病毒載體的構(gòu)建：針對大鼠Smad6基因設(shè)計(jì)并合成兩對特異性干擾片段，連接到pLK0.1質(zhì)粒中，經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后抽取質(zhì)

5、粒，經(jīng)瓊脂糖電泳和測序鑒定后在HEK－293T細(xì)胞內(nèi)包裝慢病毒干擾載體，同時(shí)構(gòu)建陰性對照組慢病毒載體。(2)Smad6基因慢病毒載體的篩選：體外分離擴(kuò)增大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按照梯度稀釋法加入不同數(shù)量的慢病毒顆粒過夜感染，篩選能夠達(dá)到有效感染效率(80％以上)的最低病毒量作為下一步的實(shí)驗(yàn)條件。按照上述條件以重組慢病毒感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，定量PCR和Western-Blot分別檢測Smad6基因和蛋白的抑制的效率，觀察基因抑制后細(xì)

6、胞細(xì)胞形態(tài)的變化，MTS法繪制細(xì)胞的生長曲線。(3)體外成骨分化實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞分成以下2組：shSmad6組和陰性對照組(NC組)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在含有地塞米松、β－甘油磷酸和維生素C的成骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)。檢測方法包括：堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶定量檢測、茜素紅染色、VonKossa染色、RT-PCR及熒光定量PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)(Runx2、堿性磷酸酶、骨涎蛋白、骨鈣素)。(4)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠橈骨骨缺損的

7、研究：30只大鼠分3組：shSmad6+β-TCP組(n=10)、NC+β-TCP組(n=10)、β-TCP(n=10)，觀察方法包括：X線觀察、HE組織學(xué)檢查和骨組織形態(tài)計(jì)量分析。
　　 結(jié)果：(1)根據(jù)大鼠Smad6基因，選擇2個(gè)靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了2對shRNA寡核苷酸片段，并成功連接到pLK0.1載體中，經(jīng)基因測序鑒定插入片段和設(shè)計(jì)的片段一致。在HEK-293T細(xì)胞內(nèi)包裝成慢病毒顆粒。(2)重組慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)

8、胞后，經(jīng)熒光定量PCR和Western-Blot檢測其內(nèi)源性的Smad6基因和蛋白的表達(dá)明顯降低，表明Smad6基因慢病毒干擾載體已成功構(gòu)建。進(jìn)一步通過細(xì)胞生長曲線和MTS檢測發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的Smad6基因干擾后細(xì)胞增殖未受明顯影響。(3)體外成骨分化實(shí)驗(yàn)顯示shSmad6組堿性磷酸酶的表達(dá)明顯高于陰性對照組(p<0.05)，shSmad6組鈣結(jié)節(jié)形成的數(shù)量明顯多于陰性對照組。shSmad6組Runx2、堿性磷酸酶、骨涎蛋白和

9、骨鈣素的基因表達(dá)也明顯高于陰性對照組(p<0.05)。(4)體內(nèi)修復(fù)大鼠橈骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)：①X線結(jié)果：術(shù)后12周：shSmad6+β-TCP組中10只有8只完全骨愈合，NC+β-TCP組10只有4只骨愈合，β-TCP組未見明顯骨愈合。X線療效評分結(jié)果顯示shSmad6+β-TCP組明顯高于NC+β-TCP組(P<0.05)；②組織學(xué)和組織計(jì)量分析結(jié)果：術(shù)后12周shSmad6+β-TCP組大量的新生骨形成，骨缺損基本完全愈合，NC+β-