年齡相關(guān)基因IGFBP7調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究.pdf

1、人類正邁入一個老齡化的社會。老齡化帶來的骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松骨折的增加是一個亟需重視的問題。大量的證據(jù)證明老年性骨質(zhì)疏松癥是一種多基因疾病，基因間的互相調(diào)控在骨代謝中發(fā)揮了重要的作用。而且老年性的骨質(zhì)疏松是骨低轉(zhuǎn)換的疾病，以骨合成減少為主。骨的合成主要是由于細(xì)胞成骨分化而來，所以年齡相關(guān)基因?qū)Ω杉?xì)胞的調(diào)控與骨合成代謝密切相關(guān)。明確年齡相關(guān)基因?qū)呛铣纱x的影響及對干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控機制，對了解骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制，治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松骨折起

2、到重要作用。
　　既往的研究表明，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(isulin-like growth factorbonding protein7，IGFBP7)與衰老和骨代謝密切相關(guān)。但至今，IGFBP7在不同年齡的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)中的表達(dá)情況，以及在BMSCs成骨分化中的作用及機制仍不清楚。
　　所以，本研究旨在探討IGFB

3、P7基因?qū)MSCs成骨分化的影響，希望為骨合成代謝提供新的靶點。本研究通過篩選不同年齡組的BMSCs中IGFBP7的表達(dá)情況明確其與年齡的關(guān)系。同時，體外實驗，通過在BMSCs中過表達(dá)和敲低IGFBP7的表達(dá)，來明確IGFBP7在BMSCs成骨分化中的作用，并探索其信號通路調(diào)控機制。此外，體內(nèi)實驗，利用IGFBP7修飾的BMSCs修復(fù)骨缺損模型，來驗證其對骨缺損的修復(fù)影響。
　　本研究共分為以下3個部分:
　　(1)IGF

4、BP7在不同年齡組中BMSCs中的表達(dá)情況;
　　(2)IGFBP7對BMSCs成骨分化的作用及其機制研究;
　　(3)IGFBP7修飾的BMSCs膜片修復(fù)大鼠脛骨骨缺損的研究。
　　第一章 IGFBP7在不同年齡組中BMSCs中的表達(dá)情況
　　目的:
　　探索IGFBP7在不同年齡組的BMSCs中表達(dá)情況。
　　方法:
　　通過梯度離心的方法分離培養(yǎng)人BMSCs，通過流式分析鑒定提取細(xì)胞表面抗

5、原，并通過對提取細(xì)胞進行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)鑒定其多向分化能力。將不同年齡人分為年輕組（16-22歲）和高齡組（≥70歲）;年輕組15人，高齡組13人。通過ELISA檢測不同年齡組的血清中IGFBP7的表達(dá)情況。通過RT-qPCR、Western blot分析等比較兩組的BMSCs的成骨特異性的基因、IGFBP7和β-catenin的表達(dá)情況。同時比較BMSCs不同代數(shù)之間成骨特異性的基因、IGFBP7和β-catenin的表達(dá)情況。

6、
　　結(jié)果:
　　通過流式鑒定顯示提取的細(xì)胞CD73陽性率為99.8％，CD109陽性率為99.9％，CD105陽性率為98.5％，CD34陽性率為0.042％，CD45陽性率為0.06％，CD31陽性率為0.051％。所提取的細(xì)胞能成功進行成骨分化、成脂分化、成軟骨分化。ELISA檢測顯示高齡老人血清中的IGFBP7蛋白的表達(dá)明顯高于年輕人(P＜0.05)。老年人的BMSCs中成骨特異性的基因（RUNX2、OCN、SP7）

7、和β-catenin表達(dá)是降低的（P＜0.05），但是IGFBP7的表達(dá)是增加的（P＜0.05）。隨著傳代的增加，成骨標(biāo)志物和β-catenin表達(dá)降低(P＜0.05)，IGFBP7的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　在BMSCs中，隨著年齡的增長IGFBP7的表達(dá)增加，而成骨特異性的基因和Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)降低。
　　第二章 IGFBP7對BMSCs成骨分化的作用及其機制研究

8、>　　目的:
　　探索IGFBP7對BMSCs成骨分化的作用及其機制。
　　方法:
　　在BMSCs中，通過慢病毒載體過表達(dá)和敲低IGFBP7的表達(dá)。將BMSCs分為過表達(dá)IGFBP7組、過表達(dá)對照組、敲低IGFBP7和敲低對照組。通過臺盼藍(lán)染色鑒定IGFBP7的表達(dá)對BMSCs增殖能力的影響。通過RT-qPCR、Western blot分析和免疫熒光，檢測不同組間的成骨特異性基因表達(dá)差異。通過ALP染色和ALP活性檢

9、測，不同分組間的ALP的表達(dá)情況和活性情況。通過茜素紅染色和VonKossa染色檢測不同分組間礦化水平的差異。同時添加外源性重組IGFBP7蛋白檢測其對BMSCs的成骨分化的影響。通過Western blot分析和免疫熒光分析檢測常見成骨分化信號通路的變化。并通過抑制劑和siRNA干擾信號通路，驗證其對IGFBP7成骨影響的變化。
　　結(jié)果:
　　與對照組相比，敲低IGFBP7組的BMSCs的細(xì)胞活力明顯減低(P＜0.05)

10、，而過表達(dá)IGFBP7組的BMSCs的細(xì)胞活力無明顯變化（P＞0.05）。在成骨分化誘導(dǎo)的第3天和第7天，RT-qPCR顯示較對照組，過表達(dá)IGFBP7組BMSCs成骨特異性基因(ALP、RUNX2、SP7、COL1A1、BSP、OCN)的表達(dá)顯著升高(P＜0.05);敲低IGFBP7組BMSCs成骨特異性基因的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。免疫熒光和Western blot檢測分析顯示:在誘導(dǎo)的第1天，較對照組，過表達(dá)IGFBP7組成

11、骨特異性蛋白(RUNX2、SP7、COL1A1)的表達(dá)顯著升高;敲低IGFBP7組成骨特異性蛋白(RUNX2、SP7、 COL1A1)的表達(dá)顯著降低。ALP染色和ALP活性檢測結(jié)果顯示:成骨誘導(dǎo)3天和7天，過表達(dá)IGFBP7組ALP活性明顯升高，敲低IGFBP7組ALP的活性明顯減低(P＜0.05)。茜素紅和Von Kossa染色顯示:成骨分化誘導(dǎo)第10天，過表達(dá)IGFBP7組鈣結(jié)節(jié)積累明顯增多(P＜0.05)，敲低IGFBP7組鈣結(jié)節(jié)

12、的積累明顯減少（P＜0.05）。外源性的重組IGFBP7蛋白對BMSCs的成骨分化作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，當(dāng)濃度≥500 ng/mL時，其可以加強BMSCs的成骨分化（P＜0.05）。信號通路檢測結(jié)果顯示:成骨分化第1天，MAPK（ERK/p-38/JNK）信號通路和PI3K/Akt信號通路無明顯變化，而過表達(dá)IGFBP7可以明顯增加總β-catenin蛋白的量，而且激活狀態(tài)的β-catenin蛋白也增加。應(yīng)用特異性的Wnt/β-cate

13、nin信號通路的抑制劑DKK1(1000 ng/mL)，可以明顯減弱因為IGFBP7過表達(dá)增加的成骨分化效應(yīng)。應(yīng)用特異性的β-catenin信號siRNA，也可以明顯減弱因為IGFBP7過表達(dá)增加的成骨分化效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　在BMSCs中，IGFBP7通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控BMSCs的成骨分化。
　　第三章 IGFBP7基因修飾的BMSCs膜片對大鼠脛骨骨缺損愈合的影響
　　目的:

14、>　　探索過表達(dá)IGFBP7的BMSCs膜片對大鼠脛骨骨缺損愈合的影響。
　　方法:
　　通過體外培養(yǎng)構(gòu)建BMSCs細(xì)胞膜片。將30只SD大鼠隨機分配為3組，分別為空白組（blank組）、對照組細(xì)胞膜片組（Ctrl組）、過表達(dá)IGFBP7干細(xì)胞膜片組（exIg7組），每組10只。應(yīng)用膜片修復(fù)大鼠脛骨骨缺損。術(shù)后8周，安樂死動物后，取標(biāo)本。以X線和Mirco-CT評估骨缺損愈合情況。同時，用HE染色、番紅速綠、Masson三色

15、染色和免疫組化評估骨缺損愈合情況。GFP免疫組化追蹤移植細(xì)胞存留情況。
　　結(jié)果:
　　X線和Mirco-CT結(jié)果顯示:空白組(Blank)骨折間隙仍然清晰可見，未見明顯連續(xù)的骨痂形成;對照組(Ctrl)骨折線模糊，可見明顯的骨痂生長，礦化組織已開始連續(xù)，骨折線已經(jīng)模糊，骨缺損區(qū)域未完全愈合;過表達(dá)IGFBP7組(exIg7)骨折區(qū)域礦化組織已完全填充，骨缺損已接近愈合。HE染色、番紅速綠和Masson三色染色顯示:較空白組