Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞并促進其成骨分化的研究.pdf

1、背景：大面積骨缺損一直是創(chuàng)傷骨科的治療難題。自體骨、異體骨，以及人工骨材料的填充都難以有效治療大面積的骨缺損。骨組織工程通過整合支架材料、種子細胞、活性因子等提高人工骨材料的成骨活性，達到修復大面積骨缺損的目的。其中骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，在骨修復與重建中可分化為成骨細胞、骨細胞，繼而促進骨愈合。Runx2在成骨分化的信號途徑中起核心作用，能誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞定向分化并成熟，從而促進骨修復。
　　目的：本次實驗利

2、用重組Runx2基因的慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞，使Runx2基因在骨髓間充質(zhì)干細胞中表達水平增高，檢測其成骨相關(guān)基因表達的水平，觀察Runx2基因促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的情況。
　　方法：從骨肉瘤細胞系(MG-63)中抽提總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增Runx2基因，通過酶切與連接的方法把Runx2基因連接到慢病毒表達載體質(zhì)粒Pez-lv201。然后和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，進行病毒的包裝，以熒光法行慢病毒滴度測定。<

3、br>　　取4周齡SD大鼠脛骨，用全骨髓細胞培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。利用流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞陽性表面標記物CD90和CD105，驗證培養(yǎng)細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。預實驗得到最佳感染復數(shù)為50。將Runx2重組慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞。通過鏡下觀察，RT-PCR檢測成骨基因的表達情況，驗證Runx2重組慢病毒促進BMSCs的成骨分化。
　　結(jié)果：
　　1.通過反轉(zhuǎn)錄成功獲得目的基因Runx2基因。Runx2

4、基因與表達載體質(zhì)粒連接后，經(jīng)過酶切和測序鑒定正確。
　　2.熒光鏡下觀察，A組（含0.1μl病毒液）、B組（含0.5μl病毒液）、C組（含2.0μl病毒液）、D組（含10μl病毒液）、E組（含50μl病毒液）平均每視野范圍內(nèi)熒光細胞數(shù)分別為2個、8個、27個、163個、721個，經(jīng)計算A、B、C、D、E的病毒液滴度分別為：2*109TU/ml、1.6*109 TU/ml、1.35*109 TU/ml、1.63*109 TU/ml、

5、1.45*109 TU/ml，取平均數(shù)，可得到慢病毒液滴度為1.6*109 TU/ml。F組（空載對照組）未發(fā)現(xiàn)綠色熒光細胞。
　　3.鏡下觀察第三代培養(yǎng)細胞呈長梭形、紡錘形及多角形貼壁生長，符合骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)特征。流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞陽性表面標記物CD90和CD105，表達率分別為99.8％、99.3%。說明骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)成功。
　　4.慢病毒感染BMSCs后，實驗組（BMSCs-Runx2）細胞胞

6、體變大，呈多角形、鱗片形，胞漿變多，細胞核增大，可有多核；而對照組（control BMSCs）細胞形態(tài)未見明顯改變，說明Runx2重組慢病毒促BMSC成骨分化。
　　5.實驗組（BMSCs-Runx2）Runx2、OCN、osteonectin、ALP、BMP-2、OPN等成骨特異性基因的表達水平隨時間推移而增高，在第14天時達到最高；其中BMP-2表達最強；對照組（BMSCs）上述基因無表達。說明Runx2重組慢病毒可使骨髓間