樹豆內(nèi)酯A調(diào)節(jié)Wnt-β-catenin-runx-2信號(hào)通路促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是多種原因引起的一種全身骨骼代謝性疾病，以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)受損為主要特征，導(dǎo)致脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加。骨組織形成的減少、骨質(zhì)吸收增多是骨質(zhì)疏松的主要病因。Wnt/β-catenin/Runx-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、凋亡等過(guò)程，是骨代謝過(guò)程中重要的信號(hào)系統(tǒng)。
　　目的:
　　本組前期從具有增強(qiáng)骨丟失小鼠骨密度的樹豆植物藥用脂溶性部位中分離到了具有促成骨細(xì)胞分化活性、增強(qiáng)小鼠骨密度的一種作為植物藥

2、用部位提取蔗類單體成分樹豆內(nèi)酯A(CLA)。為了探討CLA促進(jìn)成骨的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)為模型，探討CLA對(duì)定向誘導(dǎo)的hMSCs成骨分化的影響，具體探討其對(duì)成骨分化信號(hào)通路的影響，為CLA用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)CLA對(duì)hMSCs增殖的作用:生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4-6代hBMSCs細(xì)胞和不同濃度CLA在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48h或72h。CCK-8法

3、檢測(cè)細(xì)胞活力，評(píng)價(jià)CLA對(duì)細(xì)胞增殖的影響;(2)CLA對(duì)hBMSCs成骨分化作用:生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hBMSCs第5代細(xì)胞在不同濃度CLA存在下，用成骨分化培養(yǎng)液對(duì)hBMSCs進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，在誘導(dǎo)的周期內(nèi)分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色及茜素紅S染色，觀察其成骨活性和鈣結(jié)節(jié)形成情況，判斷CLA對(duì)hBMSCs成骨分化的作用;(3)CLA對(duì)hBMSCs成骨分化過(guò)程中Wnt/β-catenin

4、/runx-2信號(hào)通路的影響:取第5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hBMSCs，分別在不同濃度CLA存在下進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，以未添加CLA的誘導(dǎo)組為陽(yáng)性對(duì)照組，以未進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞為陰性對(duì)照組;分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)第24h，3d、6d、9d和12d提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)成骨前期轉(zhuǎn)錄因子Runx-2與Osterix，及Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路的Wnt-3a，Wnt-5a，Wnt-10b，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6

5、(LRP-5/6)，F(xiàn)rizzled(Fz)共受體，以及β-catenin基因的表達(dá)量。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第15d提取總蛋白，蛋白印跡法(WesternBlot)檢測(cè)Runx-2、β-catenin，Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)，骨形態(tài)學(xué)蛋白(BMP-2)，骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1)CLA在10μmol/L及以下濃度作用于hBMSCs48，72h，不影響細(xì)胞的增殖，在20μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出

6、一定的抑制作用;(2)在誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化過(guò)程中，堿性磷酸酶與茜素紅S染色結(jié)果顯示，CLA的三個(gè)劑量（4，2和1μmol/L）均有良好的促成骨分化作用，但是CLA4μmol/L與2μmol/L兩個(gè)劑量的作用效果沒有明顯的量效關(guān)系;(3)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示:與未誘導(dǎo)分化組相比，誘導(dǎo)分化各組的細(xì)胞在分化周期第24h，3d、6d、9d和12d均檢測(cè)到Wnt-3a，Wnt-10b，LRP-5，β-catenin，Runx-2

7、與Osterix基因mRNA水平有明顯上升;與誘導(dǎo)對(duì)照組相比，CLA三個(gè)劑量(2，1，0.5μmol/L)對(duì)這些基因的表達(dá)在第24h出現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用，而在第3天或者6天各基因表達(dá)量均達(dá)到峰值，并出現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。第6天后，各基因表達(dá)量均出現(xiàn)表達(dá)量下降的趨勢(shì)，并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的加長(zhǎng)，趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，藥物作用無(wú)明顯量效關(guān)系;(4)蛋白印跡法(WesternBlot)結(jié)果顯示:在誘導(dǎo)分化第15天，與未分化相比，誘導(dǎo)分化組的Runx-2，β-