辛伐他汀經(jīng)p38MAPK信號通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞中-晚期成骨分化的作用.pdf

1、目的:辛伐他汀作為競爭性3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hyd ro xy-3-methylglutaric acid,HMG-CoA）還原酶抑制劑，在以往的大量實驗已經(jīng)被證明具有誘導(dǎo)成骨分化作用。本實驗選用辛伐他汀（Simvastatin，SIM）體外給藥,對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化中晚期的影響進行研究。探討在成骨誘導(dǎo)成分環(huán)境下，辛伐他汀對BM

2、SCs在成骨分化中晚期作用的最佳起效時間和p38MAPK通路的影響。
　　方法：SPF級雌性SD大鼠20只，應(yīng)用脫頸法處死大鼠，在無菌條件下取雙側(cè)股骨和脛骨，全骨髓培養(yǎng)法進行原代和傳代培養(yǎng)。原代細胞傳代后，根據(jù)實驗需要隨機分為對照組（Control medium group，CM）：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；辛伐他汀組（Simvastatin medium group，SIM）：含有10-7mol/L辛伐他汀的完全培養(yǎng)基；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組（

3、Osteoinduce medium group，OM）：含有10mmol/Lβ甘油磷酸鈉和50μg/ml抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；辛伐他汀和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組（SimvastatinandOsteoinduce mediumgroup，OM+SIM）：終濃度為10-7mol/L的辛伐他汀和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。阻斷劑組（SB203580+ Simvastatin+Osteoinduce mediumgroupgroup，SB+OM+SIM

4、）：先用p38MAPK通路阻斷劑SB203580干預(yù)30min后，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基和濃度為10-7mol/L的辛伐他汀誘導(dǎo)。選取CM組和SIM組MTT法檢測第2d、3d、4d、5d和6d細胞活性；選取OM組和OM+SIM組，提取第7天和第14天細胞，ELISA法檢測ALP表達，OM組和OM+SIM組于傳代后第21天和第28天給藥1h、12h、24h后，提取蛋白和RNA檢測OCN的蛋白和RNA表達水平，確定藥物作用最佳時間后，檢測該時間點O

5、M組、OM+SIM組和SB+OM+SIM組p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.MTT檢測：10-7mo l/L濃度的辛伐他汀對細胞增殖和細胞活性無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.ELISA：第7天各組 ALP表達量最高（P＜0.05），而OM+SIM組顯著高于OM組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異（P＜0.05）。
　　3.Real-timePCR檢測：第21、28天各組

6、OCN mRNA在給藥后第12h表達量最高（P＜0.05）且OM+SIM組明顯高于OM組，統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　4.Western blot檢測：第21、28天各組OCN在給藥后12h表達最高，統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著性差異（P＜0.05），OM+SIM組明顯高于OM組（P＜0.05）。藥物干預(yù)12h后OM+SIM+SB組p-p38明顯低于其他兩組（P＜0.05），OM+SIM組p-p38表達高于OM組，統(tǒng)計學(xué)