體外沖擊波對(duì)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨活性因子及MAPK信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：在成功體外分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的基礎(chǔ)上，研究體外沖擊波(ESW)干預(yù)對(duì)hMSCs增殖分化及成骨活性因子和酶聯(lián)信號(hào)分子表達(dá)的影響，探討ESW促進(jìn)成骨過(guò)程中MAPK酶偶聯(lián)信號(hào)通路的狀態(tài)，為揭示ESWT治療成骨障礙性疾病的機(jī)理提供理論依據(jù)。 方法：自早期成人股骨頭壞死(ANFH)患者髂骨行骨髓穿刺抽取骨髓，采用密度梯度離心法提取hMSCs；經(jīng)體外培養(yǎng)成功后，應(yīng)用MTT法測(cè)定增殖活力，以確定ESW干預(yù)的合適劑量

2、；施加ESW干預(yù)后，分別利用倒置相差顯微鏡、HE染色隔代(P1-P11)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、貼壁率和倍增時(shí)間等變化，應(yīng)用酶細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)堿性磷酸酶含量、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-I)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGFβ1)表達(dá)，以及磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(pERK1/2)水平；使用PD98059阻斷其上游激酶MEK，觀察干預(yù)組pERK1/2及TGFβ1表達(dá)變化。對(duì)上述各部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相應(yīng)的方差分析、配對(duì)t檢驗(yàn)、

3、X2檢驗(yàn)和相關(guān)分析，設(shè)定P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果：1體外沖擊波對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響顯著：3kY即可以促進(jìn)hMSCs的生長(zhǎng)，5kV的ESW的促進(jìn)增殖作用最強(qiáng)(P＜0.01)。高于7kY的ESW干預(yù)將抑制hMSCs貼壁、存活和增殖，生長(zhǎng)峰值低于對(duì)照組。ESW干預(yù)體外培養(yǎng)hMSCs的最佳能量為5kV(100次)。 2原代hMSCs細(xì)胞呈圓或扁圓形，48h內(nèi)陸續(xù)沉底貼壁，7～9d自細(xì)胞兩極伸出足狀的突起，呈短梭形或

4、多角形，胞體透亮，折光性好；細(xì)胞多至瓶底的80％即可消化傳代。 3傳代細(xì)胞經(jīng)HE染色，胞漿紅染，核呈深藍(lán)色，核仁明顯。ESW干預(yù)后的P1代hMSCs增殖分裂加快，胞漿豐富，胞核較大，核仁2～3個(gè)；P3-P5代hMSCs核分裂相多，核漿比值大，增殖高峰提前，細(xì)胞簇集融合，呈放射狀擴(kuò)展；P7-P9代細(xì)胞體積增大明顯，3～5d即呈條帶狀交錯(cuò)成片，基質(zhì)堆積成束，方向性明顯。干預(yù)后的P11代hMSCs仍有核分裂細(xì)胞呈對(duì)稱(chēng)分裂，表現(xiàn)出定向成

5、骨分化的潛能；而對(duì)照組為不對(duì)稱(chēng)分裂和多種分裂方式，存在多向分化的可能。 4ESW干預(yù)后的P5代hMSCs貼壁率為61.54％，明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)；隨后兩組細(xì)胞的貼壁率差異逐漸加大。細(xì)胞倍增時(shí)間的變化與貼壁率并不同步：P3代干預(yù)組hMSCs提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，倍增時(shí)間(Td)較對(duì)照組縮短1.72d；P5代干預(yù)組Td短于3d，細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)；隨后細(xì)胞成骨分化活躍，以膠原合成為主，核漿比驟減，P7代干預(yù)組Td短于延長(zhǎng)至4

6、.45d。與對(duì)照組相比，ESW干預(yù)明顯縮短了hMSCs的倍增時(shí)間(P＜0.05)。 5對(duì)照組堿性磷酸酶(ALP)曲線(xiàn)近似呈S型，有明顯的潛伏期(P0-P3)、指數(shù)生長(zhǎng)期(P3-P7)和平頂期(P7之后)。ESW干預(yù)明顯縮短了hMSCs生長(zhǎng)潛伏期，1周后ALP含量即明顯上升約14.2KU，增殖高峰提前在P5代出現(xiàn)(38.7KU)；干預(yù)組ALP總體水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。 6ESW干預(yù)后的P3代hMSCs胞漿及胞

7、核中出現(xiàn)大量黃色-棕黃色顆粒，IGF-Ⅰ陽(yáng)性率為42.3％，而對(duì)照組無(wú)明顯著色；P7代干預(yù)組細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)87.9％，對(duì)照組開(kāi)始出現(xiàn)IGF-Ⅰ染色明顯陽(yáng)性的細(xì)胞，較干預(yù)組晚4代，約25d。兩組間差異顯著(P＜0.01)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中TGF-β1出現(xiàn)較晚；ESW干預(yù)組P5代僅見(jiàn)個(gè)別細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)，P7代hMSCs胞漿可見(jiàn)均勻、淡染黃色顆粒，P9代TGF-β1染色陽(yáng)性率為72.2％，個(gè)別細(xì)胞漿內(nèi)尚見(jiàn)深染的棕褐色顆粒；隨后陽(yáng)性

8、率開(kāi)始下降。對(duì)照組始終沒(méi)有出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性表達(dá)，兩組間差異顯著(P＜0.01)。TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)較IGF-Ⅰ晚6代，約40d，高峰持續(xù)時(shí)間短，僅在P9代干預(yù)組細(xì)胞。 7ESW干預(yù)后pERK1/2與TGF-β1的表達(dá)并不同步：P3代hMSCs胞漿內(nèi)即出現(xiàn)黃染顆粒，pERK1/2弱陽(yáng)性；對(duì)照組僅P9代個(gè)別hMSCs陽(yáng)性(P＜0.01)。干預(yù)組P9代hMSCs中pERK1/2活躍，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與TGF-β1高峰同代出現(xiàn)；經(jīng)PD9805

9、9阻斷其上游激酶MEK后，pERK1/2表達(dá)顯著減弱(P＜0.01)，而TGF-β1染色仍呈均勻陽(yáng)性(P＞0.05)。 結(jié)論：5kV(100次)的ESW是體外干預(yù)hMSCs試驗(yàn)的最佳能量；ESW干預(yù)能夠提高h(yuǎn)MSCs的貼壁、增殖及成骨活性，不同程度的促進(jìn)了成骨活性因子的生成；ESW的骨科生物學(xué)作用可能是通過(guò)MAPK酶偶聯(lián)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，TGF-β1在hMSCs增殖晚期參與了ESW對(duì)ERK激酶的激活；這一過(guò)程應(yīng)該還有其它成骨活性因