炎性因子TNF-α對SD大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響.pdf

1、目的:
　　探討不同濃度TNF-α對骨髓間充質干細胞增殖及其分化成骨的影響，并進一步探討TNF-α對成骨分化過程中BMP-2/Smads信號通路的調控作用，初步了解炎癥微環(huán)境下骨折愈合的特殊性。
　　方法:
　　1、細胞培養(yǎng)及鑒定
　　采用全骨髓法分離培養(yǎng)SD大鼠原代骨髓間充質干細胞，流式細胞儀檢測細胞表面標記物。
　　2、實驗分組
　　實驗分為5組，以在促成骨分化培養(yǎng)基(Osteogenic med

2、ia，OM)中培養(yǎng)的大鼠BMSCs為對照組，OM中加入不同濃度TNF-α(0.1、1、10、100ng/ml)為實驗組。
　　3、細胞增殖活性檢測
　　CCK-8檢測各組細胞增值活性。
　　4、堿性磷酸酶活性檢測
　　AKP試劑盒測定各組堿性磷酸酶活力。
　　5、鈣結節(jié)含量檢測
　　茜素紅礦化結節(jié)染色觀察各組鈣結節(jié)礦化程度。
　　6、Real-Time PCR檢測
　　采用Real-Tim

3、e PCR檢測不同濃度TNF-α下BMP-2、Smad1 mRNA的表達量。
　　7、統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件和InstallPrism6圖像分析軟件對相關數據進行分析并制圖，數據以均值±標準差(X±S)表示，配對樣本t檢驗用于分析實驗組與對照組的差異性，以P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、細胞培養(yǎng)及鑒定:
　　流式細胞儀檢測出CD31、CD34、CD44、CD

4、90的陽性表達率分別為6.09％、8.27％、97.10％、96.67％，證實所分離培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質干細胞。
　　2、CCK-8結果顯示:
　　與對照組(TNF-α=0ng/ml)相比，在加入含TNF-α的礦化誘導液1、3、5、7天后，中高濃度TNF-α(10、100ng/ml)組的BMMSCs增值活性顯著降低(P＜0.05);但是，低濃度TNF-α(1ng/ml)組的細胞活性在第3天升高后又在第7天顯著降低(P＜0.

5、05)。
　　3、ALP活性檢測結果顯示:
　　與對照組(TNF-α=0ng/ml)相比，在加入含TNF-α的礦化誘導液1、3、5、7天后，中高濃度TNF-α(10、100ng/ml)組的BMMSCs堿性磷酸酶活力顯著降低(P＜0.05）;但是，低濃度TNF-α(1ng/ml)組的細胞堿性磷酸酶活力在第3天升高后又在第5和第7天顯著降低(P＜0.05)。
　　4、茜素紅礦化結節(jié)染色結果顯示:
　　與對照組(TNF

6、-α=0ng/ml)相比，在加入含TNF-α的礦化誘導液7天后，低濃度TNF-α(1ng/ml)組BMMSCs礦化結節(jié)含量無明顯差異（P＞0.05）;中高濃度TNF-α(10、100ng/ml)組BMMSCs鈣結節(jié)含量減少(P＜0.05，表3、圖10）;在第14天，低中高濃度TNF-α(1、10、100ng/ml)組BMMSCs鈣結節(jié)含量均減少(P＜0.05)。
　　5、實時定量PCR結果顯示:
　　與對照組相比，低濃度TN

7、F-α(1ng/ml)組BMP-2 mRNA表達水平在成骨誘導第3天和第5天分別增加，在培養(yǎng)第7天又下降(P＜0.05)，Smad1 mRNA表達水平在成骨誘導第3天和第5天分別增加(P＜0.05)，在培養(yǎng)第7天又下降，但是與對照組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。在培養(yǎng)第3、5、7天后，與對照組相比，中高濃度TNF-α(10、100ng/ml)組BMP-2 mRNA水平顯著增加(P＜0.05），但是Smad1 mRNA表達水平卻顯著減