Sonic hedgehog信號調控BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化.pdf

1、目的：
　　分析Sonic hedgehog（Shh）信號對骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（Bone Morphogenetic Proteins9，BMP9）調控的間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）骨向分化的影響，并探究這種作用的調控機制。
　　方法：
　　BMP9處理MSCs，1、3、5 d后，RT-PCR和Western Blot檢測Hedgehog（Hh）信號相關分子的表達。緊接著，用cy

2、clopamine（Hh信號抑制劑）和purmorphamine（Hh信號激活劑）分別作用于BMP9處理的MSCs，化學發(fā)光檢測早期成骨標志物堿性磷酸酶（ALP）活性，茜素紅S染色檢測晚期的鈣鹽沉積。包裝腺病毒Ad-Shh（過表達Shh）和Ad-siShh（干擾Shh），RT-PCR和Western Blot分析病毒效果。隨后分別檢測Ad-Shh和Ad-siShh對BMP9調控的MSCs骨向分化的作用：化學發(fā)光和細胞化學染色檢測ALP變

3、化；茜素紅S染色檢測鈣鹽沉積；RT-PCR和Western Blot檢測晚期成骨標志物骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）和骨鈣素（Osteocalcin，OCN）以及BMP9下游成骨相關基因Dlx5、Runx2、Id1、Id2、Id3、CTGF和Col1的表達；Micro-CT以及組織細胞染色（H＆E、Masson三色和阿辛藍）觀察Ad-Shh對BMP9引起的裸鼠皮下異位成骨的影響。熒光素酶報告基因實驗檢測 Ad-Shh對 BM

4、P9誘導的 Smad1/5/8轉錄調控活性的影響；Western Blot檢測Ad-Shh對BMP9誘導的Smad1/5/8、MAPK磷酸化以及總的Smad1/5/8和磷酸化Smad1/5/8核內聚集的影響。
　　結果：
　　BMP9可影響Hh信號相關基因的表達；抑制或激活Hh信號可減弱或增強BMP9所導致的MSCs向成骨細胞分化。Ad-Shh增強了BMP9誘導的體外骨向分化過程，促進了BMP9誘導的體內成骨包塊形成；相反，