DLX1對BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化的影響.pdf

1、為了研究同源結構域轉錄因子家族成員DLX1對間充質干細胞成骨分化的影響，骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bone morphogenetic proteins9，BMP9）作用于小鼠間充質干細胞C3H10T1/2、小鼠胚胎成纖維細胞iMEFs和小鼠成肌細胞C2C12，通過PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)BMP9可以促進DLX1的mRNA水平和蛋白水平表達。過表達DLX1的重組腺病毒感染C3H10T1/2細胞、iMEFs細胞和C2C12細胞，在

2、此基礎上再用BMP9腺病毒的條件培養(yǎng)基處理細胞，分別利用化學發(fā)光法和染色法定量和定性地檢測早期的成骨分化指標堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性，發(fā)現(xiàn)BMP9可以促進細胞的ALP活性升高，并且在C3H10T1/2細胞中，DLX1可以促進BMP9誘導的細胞ALP的活性。值得注意的是，在iMEFs細胞中，雖然BMP9可以誘導其ALP活性升高，但是DLX1對BMP9的誘導作用卻沒有明顯影響。而對C2C12細胞而

3、言，BMP9誘導的ALP活性會受到DLX1的抑制。用同樣的處理方式作用于C3H10T1/2細胞，分別使用Western Blot和PCR檢測成骨指標Osteopontin(OPN)和Osteocalcin(OCN)的表達情況。
　　結果顯示，BMP9可以促進OPN和OCN的表達，而DLX1能進一步增強BMP9對其表達的誘導作用。同樣的方法處理C3H10T1/2細胞和iMEFs細胞后，通過茜素紅染色檢測晚期成骨指標鈣鹽沉積，發(fā)現(xiàn)BM

4、P9可以誘導細胞的鈣鹽沉積增多，而且DLX1可以增強BMP9對其的誘導作用。為了進一步驗證DLX1對成骨分化的作用，采用腺病毒DLX1感染C3H10T1/2細胞，在BMP9的作用下，利用PCR技術檢測成骨分化的標志性基因inhibitor of deifferentiation1(Id1)、Id2、Id3、Osterix、osteoprotegerin(OPG)、DLX5、connective tissue growth factor(

5、CTGF)和Runt-related transcription factor2（Runx2）的表達，發(fā)現(xiàn)BMP9均可誘導靶基因的表達，并且DLX1可以促進BMP9對靶基因表達的誘導作用。DLX1腺病毒和BMP9條件培養(yǎng)基作用于C3H10T1/2細胞后，通過檢測熒光素酶報告基因的活性和Western Blot來探索DLX1與Smad信號通路之間的關系。結果發(fā)現(xiàn)，DLX1和BMP9均可以增強Smad熒光素酶報告基因的活性，并且DLX1可以

6、促進BMP9的作用;Western印跡顯示，DLX1不影響B(tài)MP9誘導的Smad1/5/8的磷酸化水平，兩者對總蛋白水平?jīng)]有影響。為了更全面地驗證DLX1對間充質干細胞成骨分化的影響，構建了4個DLX1的siRNA質粒并將其成功包裝成腺病毒，用此腺病毒分別感染C3H10T1/2細胞，利用PCR和Western Blot驗證其干擾是否有效，結果表明這4種腺病毒均能有效地干擾DLX1的表達。4種腺病毒采用不同感染效率的劑量分別處理C3H10

7、T1/2細胞，在BMP9作用的基礎上，應用化學發(fā)光法和染色法檢測成骨分化指標ALP的活性。結果發(fā)現(xiàn)，在4種siRNA腺病毒中，有兩種在低感染效率和高感染效率時對C3H10T1/2細胞中由BMP9誘導的ALP活性的作用不同:低感染效率時可以促進其ALP活性，而高感染效率時對其活性的影響則表現(xiàn)為抑制。其他兩種腺病毒對C3H10T1/2細胞中BMP9誘導的ALP活性的影響均表現(xiàn)為抑制。上述結果表明DLX1能夠促進由BMP9所誘導的間充質干細胞