miR-23b調(diào)控BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分miR-23b對(duì)BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的調(diào)控
　　目的：驗(yàn)證前期篩選出的microRNAs（miRNAs）在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程中存在的表達(dá)差異，同時(shí)探討其功能。
　　方法：Ad-BMP9感染間充質(zhì)干細(xì)胞系（C3H10），qPCR在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)前期研究中篩選出的miRNAs。與此同時(shí)使用qPCR檢測(cè)成骨特異性基因ALP等在第三天的表達(dá)。使用miR-23b模擬物對(duì)BMP9誘導(dǎo)C3H10和C2C12細(xì)

2、胞成骨細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)，第七天和第十四天分別采用ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)磷酸鹽和鈣鹽沉積。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，首先使用Ad-BMP9感染C3H10細(xì)胞，再用miR-23b長(zhǎng)效模擬物轉(zhuǎn)染C3H10細(xì)胞，將細(xì)胞移植入4周左右裸鼠皮下，構(gòu)建異位成骨模型。4周后，處死小鼠，取出皮下異位骨，microCT檢測(cè)異位骨的骨體積和骨密度，骨組織脫鈣，切片，進(jìn)行HE染色和masson染色。
　　結(jié)果：qPCR檢測(cè) BMP9誘導(dǎo) MSC成骨分化開(kāi)始7天內(nèi)

3、miR-23b，miR-155和miR-21的表達(dá)，miR-23b的表達(dá)在BMP9誘導(dǎo)的早期成骨中處于下調(diào)狀態(tài)，第三天時(shí)達(dá)到表達(dá)最低點(diǎn)，對(duì)比第一天約下調(diào)了3倍；而另外兩個(gè)miRNAs的表達(dá)都上調(diào)，miR-155和miR-21的表達(dá)在第五天時(shí)對(duì)比第一天分別上調(diào)約19倍和11倍。同時(shí)，qPCR結(jié)果也驗(yàn)證了在BMP9誘導(dǎo)的成骨分化過(guò)程中，ALP、Runx2、OCN和OPN的mRNA的表達(dá)升高。使用 miR-23b模擬物 mimics和 inh

4、ibitor外源性上調(diào)和沉默C3H10細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中miR-23b的表達(dá)量，ALP染色和定量結(jié)果，以及茜素紅染色結(jié)果表明miR-23b能通過(guò)抑制ALP活性和鈣鹽沉積抑制BMP9誘導(dǎo)MSC成骨分化的能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，microCT掃描異位骨組織并3D重建計(jì)算骨體積和骨密度，miR-23b能夠抑制BMP9誘導(dǎo)C3H10皮下成骨的體積而對(duì)骨密度沒(méi)有顯著性影響。骨組織的組織化學(xué)染色， HE染色和masson染色結(jié)果顯示miR-23b能抑制

5、異位骨的成熟度。
　　結(jié)論：通過(guò)芯片結(jié)果和qPCR結(jié)果互相驗(yàn)證，確定了miR-23b等在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的表達(dá)存在差異。體外和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，miR-23b能夠抑制BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力，并能夠抑制骨的體積的分化成熟，影響體內(nèi)成骨。
　　第二部分miR-23b調(diào)控BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化靶基因的尋找和驗(yàn)證
　　目的：生物信息學(xué)方法尋找miR-23b在調(diào)控BMP9誘導(dǎo)MSC成骨

6、分化過(guò)程中的靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法：通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan，PicTar，和miRbase進(jìn)行聯(lián)合檢索，尋找miR-23b可能的靶基因。qPCR和免疫印跡法（Western blot，WB）驗(yàn)證在miR-23b調(diào)控BMP9誘導(dǎo)MSC成骨分化模型中靶基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。設(shè)計(jì)構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，檢測(cè)miR-23b與靶基因3’-UTR區(qū)域的結(jié)合能力。干擾miR-23b靶基因Runx2的表達(dá)，檢

7、測(cè)miR-23b調(diào)控BMP9誘導(dǎo)MSC成骨分化模型中成骨特異基因ALP等的表達(dá)。
　　結(jié)果：檢索不同數(shù)據(jù)庫(kù)，交叉分析，預(yù)測(cè)到Runx2，PTEN，和SATB2基因可能是miR-23b的靶基因。qPCR結(jié)果表明，miR-23b對(duì)它們mRNA水平的表達(dá)沒(méi)有顯著性影響，但是能夠抑制它們蛋白水平的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-23b能通過(guò)與它們的3’-UTR區(qū)域靶向結(jié)合，降低熒光素酶活性。在miR-23b調(diào)控BMP9誘導(dǎo)MSC

8、成骨分化模型中，通過(guò)干擾Runx2，ALP和OCN等成骨基因表達(dá)下調(diào)，同時(shí)早期成骨標(biāo)志物ALP活性降低。
　　結(jié)論：Runx2，PTEN和SATB2是miR-23b調(diào)控BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的靶基因，其中Runx2是miR-23b發(fā)揮調(diào)控作用的重要的靶基因。
　　第三部分甲基化對(duì)BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的影響
　　目的：分析甲基化作用對(duì) BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的影響，以及對(duì)miRNAs表達(dá)的影響。<

9、br>　　方法：使用去甲基化的藥物5-氮雜-2-脫氧胞苷（5az）處理BMP9誘導(dǎo)C3H10和C2C12成骨分化模型，首先篩選5az作用細(xì)胞的最佳濃度；使用該濃度處理細(xì)胞后五天，qPCR檢測(cè)成骨特異性基因 Runx2等的mRNA水平和miRNAs的表達(dá)，同時(shí)對(duì)早期成骨標(biāo)志物ALP進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：通過(guò)ALP染色和定量結(jié)果表明5az在10mM終濃度時(shí)，能夠較好的促進(jìn) BMP9誘導(dǎo) MSC成骨分化同時(shí)損傷細(xì)胞。qPCR檢測(cè)MSC中

10、各成骨特異性基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，5az能上調(diào)BMP9誘導(dǎo)成骨分化過(guò)程中ATF4，Runx2，OCN，OPN的表達(dá)，均有3～4倍的上調(diào)；5az能促進(jìn)miRNAs的表達(dá)，miR-23b表達(dá)上調(diào)3.8倍，miR-21上調(diào)2.4倍，miR-155上調(diào)4.5倍。ALP染色結(jié)果顯示，去甲基化作用能夠促進(jìn)磷酸鹽的沉積。
　　結(jié)論：甲基化調(diào)控能夠直接通過(guò)促進(jìn)成骨基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSC成骨分化，同時(shí)也能促進(jìn)miRNA的表達(dá)，間接影響該過(guò)程。