Wnt-β-catenin信號通路對炎癥狀態(tài)下牙周膜干細胞成骨分化的調控機制研究.pdf

1、牙周炎是一類以牙齦炎癥和牙槽骨吸收為主要特征的慢性炎癥性疾病。現(xiàn)有的治療方法如牙周刮治，甚至引導組織再生術等，均不能獲得牙周組織的完全再生。牙周膜干細胞（periodontalligamentstemcells,PDLSCs）的發(fā)現(xiàn)為牙周炎的治療提供了新的思路和方法。近年來已有許多研究報導，PDLSCs復合組織工程支架材料可在體內形成牙骨質/牙周膜樣結構。牙周炎患者的牙周組織再生是受到抑制的，然而關于炎癥狀態(tài)下PDLSCs的生物學行為和

2、牙周組織再生能力的改變卻鮮有報道，其具體分子機制尚不清楚。
　　干細胞內部有許多錯綜復雜的信號通路調控著干細胞的命運和數(shù)目，其中Wnt信號通路在骨的形成和改建過程中發(fā)揮了重要作用。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)在炎癥牙周組織來源的PDLSCs中檢測到了高表達的β-catenin，提示Wnt/β-catenin信號通路可能與炎癥狀態(tài)下PDLSCs的成骨分化有關。糖原合成激酶3β（glycogensynthasekinase-3β,GSK3β）

3、是Wnt經典通路中非常重要的負性調控因子，參與了包括炎癥在內的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。基于這些研究，我們提出假設：炎癥微環(huán)境可造成PDLSCs中GSK3β的功能發(fā)生改變，繼而引發(fā)下游Wnt/β-catenin信號通路的激活和成骨分化能力的下降。
　　實驗分為兩個部分：
　　1.炎癥牙周組織來源的牙周膜干細胞生物學行為的觀察。
　　目的：通過比較正常及炎癥組織來源的PDLSCs（H-PDLSCs和P-PDLSCs）增殖和分

4、化能力，探討炎癥微環(huán)境對PDLSCs生物學行為的影響。方法：1）從正常及炎癥感染的牙周組織中分離、培養(yǎng)PDLSCs，并采用有限稀釋法進行克隆純化。2）流式細胞儀檢測間充質干細胞表面標記。3）通過MTT細胞生長曲線、克隆形成率，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡，比較兩種PDLSCs的增殖能力。4）將正常及炎癥PDLSCs分別進行成骨、成脂誘導。通過茜素紅染色、ALP染色及ALP活性、實時定量PCR檢測成骨相關基因Runx2、ALP、BSP、O

5、CNmRNA的表達，比較兩種PDLSCs的成骨分化能力；通過油紅O染色，比較兩種PDLSCs的成脂分化能力。5）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激H-PDLSCs、P-PDLSCs和單核細胞，24h收集培養(yǎng)上清，ELISA檢測炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達。結果：1）在炎癥感染的牙周組織中同樣含有牙周膜干細胞，兩種PDLSCs都呈成纖維細胞樣的紡錘形，具有克隆形成能力，且細胞表面分子的表達基本一致

6、。2）MTT細胞生長曲線、克隆形成率和流式細胞周期檢測結果均表明，P-PDLSCs的增殖能力要高于H-PDLSCs；細胞凋亡檢測結果顯示，兩種PDLSCs的凋亡情況沒有顯著差別，但P-PDLSCs在成骨誘導之后凋亡明顯增加。3）茜素紅染色及定量、ALP染色及ALP活性、實時定量PCR結果說明P-PDLSCs的成骨分化能力要明顯低于H-PDLSCs；油紅O染色P-PDLSCs的脂滴形成量要明顯少于H-PDLSCs，說明P-PDLSCs的成

7、脂分化能力也受到了抑制。4）在LPS刺激下單核細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，其中TNF-α的上調最為顯著，但H-PDLSCs和P-PDLSCs均不會分泌炎性因子；使用TNF-α刺激H-PDLSCs可明顯抑制其成骨分化。結論：1）在炎癥微環(huán)境的作用下，PDLSCs的增殖能力提高，而成骨、成脂分化能力下降。2）在炎癥微環(huán)境中，TNF-α是抑制PDLSCs成骨分化的關鍵因子之一。
　　2.炎癥狀態(tài)下牙周膜干細胞成骨能力下降的

8、機制研究。
　　目的：研究炎癥微環(huán)境抑制牙周膜干細胞成骨分化的分子機制。方法：1）成骨誘導后，Westernblot檢測Wnt經典信號通路相關蛋白GSK3β/p-GSK3β、β-catenin在H-PDLSCs和P-PDLSCs中的表達。2）使用TNF-α刺激H-PDLSCs，Westernblot檢測GSK3β/p-GSK3β、β-catenin的蛋白表達情況。3）雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測β-catenin/TCF轉錄活性。以TO

9、PFlash為報告質粒，F(xiàn)OPFlash為陰性對照，共轉染pRL-TK作為內參對照；用Lipofectamine2000轉染。4）在成骨誘導時使用LiCl或Wnt3a處理H-PDLSCs，茜素紅染色和ALP染色觀察PDLSCs成骨分化的情況。5）siRNA轉染下調β-catenin，成骨誘導時加入TNF-α，7d后ALP染色觀察PDLSCs成骨能力的變化。結果：1）Westernblot結果顯示P-PDLSCs中p-GSK3β和β-ca

10、tenin的蛋白表達水平較H-PDLSCs增多，GSK3β總蛋白表達水平未見明顯變化。成骨誘導后，兩種PDLSCs中p-GSK3β和β-catenin的表達均有所減弱。TOPFlash/FOPFlash熒光素酶檢測，TNF-α處理組β-catenin/TCF的轉錄活性要明顯高于對照組。說明，Wnt/β-catenin信號通路在炎癥狀態(tài)下PDLSCs的成骨分化過程中起著負向調控的作用，并與GSK3β的活性抑制有關。2）p-GSK3β的表達

11、隨TNF-α的刺激呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性的增加；同時，在TNF-α的刺激下，無論是在細胞全蛋白還是核蛋白中，β-catenin的蛋白表達水平均隨著刺激濃度和時間的增加而增加。3）在使用LiCl抑制GSK3β活性或Wnt3a激活Wnt/β-catenin信號通路后，PDLSCs的成骨分化受到抑制，這與TNF-α對PDLSCs成骨分化的作用相同。4）使用小分子RNA干擾技術下調β-catenin后，ALP染色結果顯示，在TNF-α刺激下，s