丹參素聯(lián)合DickkopF-1抗體對大鼠骨髓基質干細胞成骨分化Wnt-β-catenin通路的影響.pdf

1、目的:
　　Wnt/β-catenin通路影響骨髓基質干細胞的增殖、遷移，調(diào)控其分化方向?；罨疻nt/β-catenin途徑能促進骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，而屬Dickkopf家族的Dickkopf-1(DKK-1)能夠抑制此途徑。我們的研究曾發(fā)現(xiàn)，丹參素有抗骨質疏松作用，與其能夠調(diào)控骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，刺激骨鈣素分泌，促進骨形成有關，但作用機制尚不明確。本研究通過觀察丹參素對體外大鼠骨髓基質干細胞（Bone Mar

2、row stromal stem cells，BMSCs）成骨分化能力的影響，以探討丹參素對骨髓基質干細胞分化方向的調(diào)節(jié)作用;通過對比丹參素與DKK-1抗體對骨髓基質干細胞增殖、分化的影響，以及對調(diào)控骨髓基質干細胞的分化方向的Wnt/β-catenin信號通路中的Dickkopf-1、β-catenin基因及蛋白表達的影響，以探討丹參素對骨髓基質干細胞分化方向調(diào)控的作用機制。為丹參素用于防治骨質疏松方面提供科學依據(jù)。
　　方法:<

3、br>　　通過傳代貼壁篩選法分離純化骨髓基質干細胞。應用細胞表面抗原CD45、CD90雙熒光標記后流式細胞儀計數(shù)法鑒定骨髓基質干細胞純度。選用純化的大鼠骨髓基質干細胞，通過加入不同濃度丹參素、DKK-1抗體以及丹參素聯(lián)合DKK-1抗體等藥物作用后，觀察骨髓基質干細胞堿性磷酸酶活性的變化、骨結節(jié)的形成，分析藥物對骨髓基質干細胞成骨分化能力的影響;提取細胞總RNA，經(jīng)RT-PCR檢測細胞內(nèi)Dickkopf-1 mRNA與β-catenin

4、mRNA的表達，探討丹參素是否通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來影響大鼠骨髓基質干細胞分化方向;通過檢測提取的細胞總蛋白中Dickkopf-1蛋白與β-catenin蛋白的表達量，進一步驗證丹參素影響骨髓基質干細胞分化方向的機制。
　　結果:
　　通過傳代貼壁篩選的方法分離純化得到較為均一成纖維細胞型的骨髓基質細胞，取經(jīng)傳3代的細胞進行細胞表面抗原CD45、CD90雙熒光標記，經(jīng)流式細胞儀計數(shù)，結果顯示經(jīng)傳3代后細

5、胞純度基本可達到80％，已經(jīng)能夠達到實驗要求。分離培養(yǎng)所得的骨髓基質干細胞，分別加入各個濃度丹參素、DKK-1抗體及聯(lián)合用藥，觀察藥物的作用。結果與對照組比較，濃度為5×10-6mol/L、5×10-7mol/L的丹參素，在第9天和第15天能升高骨髓基質干細胞ALP的活性(P＜0.05);0.1mg/L的DKK-1抗體在第6天即能出現(xiàn)促進BMSCs堿性磷酸酶分泌的作用;聯(lián)合用藥組促ALP作用更加明顯，且較丹參素持久(P＜0.01)。茜素

6、紅染色顯示，二者聯(lián)合用藥組促鈣化效果明顯，骨結節(jié)數(shù)量等均較空白組多，丹參素和DKK-1抗體也有促進鈣化的效果，但聯(lián)合用藥組作用更為明顯。RT-PCR結果顯示，各組細胞均能表達Dickkopf-1 mRNA與β-catenin mRNA。其中5×10-6mol/L丹參素聯(lián)合0.1mg/L DKK-1抗體組和DKK-1抗體組Dickkopf-1mRNA較對照組表達明顯降低，其它給藥組表達量也有不同程度的降低，而β-catenin mRNA的

7、結果正好相反。Western Blot結果表明，各組細胞均有Dickkopf-1和β-catenin蛋白表達，單獨應用DKK-1抗體組和聯(lián)合用藥組Dickkopf-1蛋白表達較空白對照組明顯減少，而β-catenin表達則較對照組增多。
　　結論:
　　丹參素與DKK-1抗體均有不同程度的促進大鼠骨髓基質干細胞增殖，增加BMSCs的堿性磷酸酶活性，促進骨結節(jié)形成，促進其向成骨細胞分化的作用。通過對比已知的Wnt/β-cate