炎癥微環(huán)境影響下Wnt信號通路對牙周膜干細(xì)胞骨向分化的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：干細(xì)胞是維持組織器官正常再生能力的重要基礎(chǔ)，在組織器官創(chuàng)傷缺損中干細(xì)胞通過分化促進(jìn)其再生修復(fù)。前期研究已成功從牙周膜組織中分離培養(yǎng)獲得了一種新型的成體干細(xì)胞即牙周膜干細(xì)胞。牙周膜干細(xì)胞具有成體干細(xì)胞共有的特性，具有多向分化能力以及干細(xì)胞的自我更行能力，它的這些功能使其成為骨再生修復(fù)的重要種子細(xì)胞。但是，慢性炎癥疾病中組織的再生修復(fù)能力明顯下降，最新研究顯示其原因可能是炎癥環(huán)境下干細(xì)胞再生能力受到明顯抑制。牙周炎是一種慢性炎癥疾病可

2、造成牙周組織中的牙槽骨以及軟組織均受損傷。微環(huán)境可以影響干細(xì)胞的功能，因此我們推測在牙周炎微環(huán)境作用下牙周膜干細(xì)胞的功能也受到一定的影響，牙周組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜牙周病為主要的炎性疾病因此牙周膜干細(xì)胞可作為研究炎癥微環(huán)境作用下干細(xì)胞功能的理想模型。
　　 炎癥通過改變成體干細(xì)胞的微環(huán)境，產(chǎn)生大量炎癥因子來影響內(nèi)源性干細(xì)胞介導(dǎo)的組織再生。炎癥因子在骨的損傷及修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，IL-1β和TNF-α在牙周病的進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些炎

3、癥因子作用于干細(xì)胞后可以引起其下游一系列的變化從而可以改變干細(xì)胞的功能。炎癥因子干擾正常的成體干細(xì)胞后可以引起干細(xì)胞分化能力的降低已被證實(shí)，然而尚無炎癥來源干細(xì)胞功能的相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)將首次研究炎癥來源的牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)行為，明確炎癥微環(huán)境對牙周膜干細(xì)胞骨向分化的影響。
　　 干細(xì)胞參與組織再生受多種分子信號通路的調(diào)控。牙周炎主要造成牙槽骨的損傷，骨再生成為牙周病治療的關(guān)鍵，近期的研究結(jié)果表明Wnt 經(jīng)典以及非經(jīng)典信號

4、通路在骨的發(fā)育以及再生過程中發(fā)揮重要作用。而炎癥微環(huán)境中干細(xì)胞分化過程的分子通路尚未被闡明，極大的阻礙了治療炎癥性疾病新方法和技術(shù)的發(fā)展。因此擬利用牙周炎來源的牙周膜干細(xì)胞作為炎癥微環(huán)境作用下的細(xì)胞模型，結(jié)合Wnt信號通路在干細(xì)胞骨向分化過程中的作用機(jī)制，探討炎癥微環(huán)境影響干細(xì)胞再生能力的分子機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)控，恢復(fù)炎癥疾病組織來源的干細(xì)胞的組織再生能力，是本課題著重解決的科學(xué)問題。
　　 方法：
　　 第一部分

5、:為了獲取炎癥組織來源的牙周膜干細(xì)胞，我們首先在臨床上進(jìn)行樣本收集，收集到相應(yīng)年齡段內(nèi)正常因正畸治療需拔除的健康牙齒，炎癥來源的則來自于患牙周病且伴牙槽骨吸收因牙周治療需拔除的患牙。參照正常組織來源牙周膜干細(xì)胞(H-PDLSCs)的分離培養(yǎng)方法我們成功獲得了炎癥組織來源的牙周膜干細(xì)胞(P-PDLSCs)。對兩種來源的干細(xì)胞進(jìn)行了克隆形成率的檢測，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對獲得的細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的檢測。為了比較正常以及炎癥組織來源地

6、牙周膜干細(xì)胞的功能我們用MTT 法以及流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞活性以及生長周期的檢測。干細(xì)胞具有多向分化能力，為了進(jìn)一步比較兩種組織來源的干細(xì)胞分化能力差異，對兩種細(xì)胞進(jìn)行了成脂以及成骨定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR對成骨以及成脂的關(guān)鍵基因RUNX2與PPARγ 進(jìn)行檢測。
　　 第二部分：促炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α是介導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞炎癥反應(yīng)的重要炎癥介質(zhì)。為了明確我們獲得的牙周膜干細(xì)胞在經(jīng)過體外培養(yǎng)后仍然具有炎癥

7、特性，我們以IL-1β(5 ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)構(gòu)建模擬的炎癥微環(huán)境干擾H-PDLSCs，設(shè)PBS對照組，通過Elisa和Real-time RT-PCR 方法檢測干預(yù)后24h 隨后常規(guī)狀態(tài)培養(yǎng)72h后，H-PDLSCs、P-PDLSCs、H+cytokines 三組細(xì)胞IL-1β和TNF-α分泌以及mRNA表達(dá)情況；按照上述分組Western Blot 檢測全細(xì)胞蛋白β-catenin表達(dá)水平。炎癥因子可影響細(xì)胞

8、的功能因此我們對H-PDLSCs、P-PDLSCs、H+cytokines 三組細(xì)胞進(jìn)行成骨能力檢測。將細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7d后采用免疫熒光方法檢測成骨的關(guān)鍵蛋白OCN、ALP、BSP的表達(dá)情況，同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測細(xì)胞成骨基因RUNX2、OCN、COL-1的表達(dá)水平。
　　 第三部分：為了明確炎癥微環(huán)境作用下Wnt信號通路在PDLSCs 成骨分化過程中的作用，我們將H-PDLSCs及P-PDLSCs 成骨誘導(dǎo)7d，分離提取胞

9、漿、胞核蛋白或全細(xì)胞蛋白。為準(zhǔn)確判Wnt/β-catenin信號通路在炎癥微環(huán)境作用下對干細(xì)胞成骨功能的影響，胞漿胞核分離的蛋白進(jìn)行Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測β-catenin的表達(dá)情況。Western Blot 檢測經(jīng)典Wnt信號通路重要蛋白GSK3β，非經(jīng)典信號通路CaMKII與NLK 以及成骨的關(guān)鍵蛋白p38MAPK、RUNX2、COL-1的表達(dá)水平。
　　 第四部分：Wnt3a 可以上調(diào)Wnt 經(jīng)典信號通路而DK

10、K-1則為Wnt 經(jīng)典信號通路的阻斷劑，此部分實(shí)驗(yàn)我們將應(yīng)用者兩種外源性重組蛋白調(diào)控Wnt信號通路。采用Western Blot 檢測加入Wnt3a 或DKK-1后Wnt 經(jīng)典以及非經(jīng)典信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、CaMKII、NLK。LEF-1的表達(dá)情況，同時(shí)檢測下游Cyclin D1及成骨關(guān)鍵蛋白p38的表達(dá)情況。ALP 染色觀察改變Wnt信號通路活性后干細(xì)胞成骨能力的變化，實(shí)時(shí)定量PCR 檢測成骨基因RUNX2、OCN、C

11、OL-1的變化趨勢，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：正常和炎癥組織來源的牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)行為的比較研究
　　 1.與H-PDLSCs細(xì)胞相比，P-PDLSCs的細(xì)胞形態(tài)以及克隆形成率無顯著性差異。
　　 2.通過干細(xì)胞分子表明標(biāo)記物檢測發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞表達(dá)相似的細(xì)胞表型，CD45-但是CD44+、CD90+、CD105+、CD146+、Stro-1+。
　　 3.P-PD

12、LSCs的增殖能力顯著高于H-PDLSCs。
　　 4.P-PDLSCs的成脂分化能力與成骨化能力顯著低于H-PDLSCs。
　　 第二部分：明確炎癥微環(huán)境對牙周膜干細(xì)胞骨向分化能力的影響
　　 1.炎癥微環(huán)境作用下牙周膜干細(xì)胞IL-1β和TNF-α的分泌合成量及mRNA的表達(dá)顯著高于對照組。
　　 2.炎癥微環(huán)境可導(dǎo)致β-catenin表達(dá)水平顯著升高。
　　 3.P-PDLSCs及模擬炎癥微環(huán)

13、境作用下的H-PDLSCs細(xì)胞中CyclinD1的表的水平顯著上升。
　　 4.免疫熒光結(jié)果顯示在成骨誘導(dǎo)7d后H-PDLSCs、P-PDLSCs、H+cytokines 三組細(xì)胞均強(qiáng)陽性表達(dá)成骨關(guān)鍵蛋白OCN、ALP、BSP。
　　 5. 實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，炎癥微環(huán)境作用下牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7d后RUNX2、OCN及COL-1的表達(dá)水平顯著低于H-PDLSCs。
　　 第三部分：Wnt 經(jīng)典以及非經(jīng)典

14、信號通路在炎癥微環(huán)境影響下牙周膜干細(xì)胞骨向分化過程中的作用
　　 1.H-PDLSCs與P-PDLSCs 成骨誘導(dǎo)7d后胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)水平降低而胞漿內(nèi)則有所升高。同時(shí)P-PDLSCs細(xì)胞胞漿和胞核β-catenin表達(dá)水平高于H-PDLSCs。
　　 2.Western Blot 結(jié)果提示在胞漿內(nèi)可降解β-catenin的蛋白GSK3β在成骨誘導(dǎo)7d后升高，而P-PDLSCs細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量低于H-PDLSC

15、s細(xì)胞
　　 3.非經(jīng)典信號通路的關(guān)鍵蛋白CaMKII、NLK在成骨誘導(dǎo)7d后其表達(dá)水平升高，但P-PDLSCs 低于H-PDLSCs。
　　 4.P-PDLSCs與H-PDLSCs p-p38 骨誘導(dǎo)7d后其表達(dá)水平升高
　　 5. Western Blot 檢測提示成骨誘導(dǎo)7d后P-PDLSCs與H-PDLSCs細(xì)胞的RUNX2及COL-1表達(dá)量均上升，但P-PDLSCs 低于H-PDLSCs。第四部分：調(diào)控

16、Wnt信號通路對炎癥微環(huán)境影響下牙周膜干細(xì)胞骨向分化能力的影響及機(jī)制研究1.上調(diào)Wnt信號通路后β-catenin及LEF-1的表達(dá)水平升高，Wnt 經(jīng)典信號通路的活性增強(qiáng)，與此同時(shí)非經(jīng)典信號通路則受到抑制。上調(diào)Wnt信號通路并成骨誘導(dǎo)之后觀察到P-PDLSCs與H-PDLSCs的成骨分化能力顯著降低。
　　 2.DKK-1阻斷Wnt信號通路之后β-catenin表達(dá)水平下降，但是非經(jīng)典的CaMKII、NLK表達(dá)水平上升。DKK

17、-1可顯著抑制細(xì)胞進(jìn)入G1期，抑制了細(xì)胞的增殖。成骨誘導(dǎo)后可見干細(xì)胞的成骨能力增強(qiáng)體現(xiàn)在ALP 活性升高成骨基因表達(dá)水平顯著上升。
　　 結(jié)論：
　　 1．本研究成功分離培養(yǎng)獲得了炎癥組織來源地牙周膜干細(xì)胞，通過與正常細(xì)胞對比發(fā)現(xiàn)炎癥影響下牙周膜干細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)但分化能力降低。
　　 2．本研究發(fā)現(xiàn)了炎癥影響下干細(xì)胞Wnt 經(jīng)典信號通路被激活，這是導(dǎo)致干細(xì)胞骨向分化能力降低的重要原因。
　　 3．Wn

18、t 經(jīng)典與非經(jīng)典信號通路在干細(xì)胞的骨向分化過程中均發(fā)揮重要作用。Wnt經(jīng)典信號通路的增強(qiáng)，非經(jīng)典信號通路的減弱是P-PDLSCs 骨向分化能力降低的重要原因。
　　 4.Wnt 經(jīng)典通路的增強(qiáng)可以抑制干細(xì)胞的骨向分化能力，而通過DKK-1抑制Wnt經(jīng)典信號通路后干細(xì)胞的骨向分化能力增強(qiáng)。此外，在炎癥微環(huán)境作用下干細(xì)胞內(nèi)的Wnt 經(jīng)典與非經(jīng)典信號通路之間的動(dòng)態(tài)平衡受到破壞，可以通過調(diào)控Wnt信號通路以恢復(fù)這種平衡關(guān)系，增強(qiáng)炎癥組織