靜壓力作用下經(jīng)典Wnt信號(hào)通路調(diào)控牙周膜干細(xì)胞骨向分化的機(jī)制研究.pdf

1、正畸牙移動(dòng)（orthodontic tooth movement，OTM）涉及了復(fù)雜的生物學(xué)行為，主要包括兩個(gè)層面的內(nèi)容：生物力學(xué)和生物學(xué)，前者是指機(jī)械刺激作用于牙齒，產(chǎn)生張應(yīng)力和壓應(yīng)力，而后者是指牙齒感受應(yīng)力，并將其傳遞至牙周組織，從而引發(fā)了一系列復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，二者相互關(guān)聯(lián)，協(xié)同作用。有研究證實(shí)，在OTM過(guò)程中，張力側(cè)成骨活躍，主要表現(xiàn)為以骨沉積為主的骨塑建；而壓力側(cè)成骨/破骨動(dòng)態(tài)平衡，以骨吸收為主。了解更多更新的OTM發(fā)生發(fā)

2、展的生物學(xué)基礎(chǔ)，將有助于我們更加安全有效的開展臨床工作。
　　眾所周知，在OTM過(guò)程中，牙周組織感受機(jī)械應(yīng)力，并產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，是保證牙齒移動(dòng)的關(guān)鍵因素。牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）存在于牙周組織，可自我更新，并分化為成骨細(xì)胞等成熟細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，PDLSCs參與維持牙周膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，在牙槽骨改建中發(fā)揮了一定的作用，推測(cè)其在OTM過(guò)程中扮演了重要的角色。隨后，有

3、學(xué)者利用大鼠OTM模型證實(shí)，隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)，不僅張力側(cè)牙周膜內(nèi)PDLSCs的數(shù)目逐漸增多，而且壓力側(cè)PDLSCs亦呈上升趨勢(shì)，提示其參與了OTM。而體外細(xì)胞力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)雖已發(fā)現(xiàn)，在牽張力等機(jī)械刺激的作用下，PDLSCs的增殖和分化等生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生明顯改變，但關(guān)于壓應(yīng)力對(duì)其生物學(xué)行為影響的研究很少且機(jī)制不清。但目前已有研究證實(shí)，Wnt信號(hào)通路廣泛存在于生物體內(nèi)，參與調(diào)節(jié)骨源性細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，在骨的形成和改建中發(fā)揮了重要的

4、作用。
　　因此本課題首先建立大鼠OTM模型，通過(guò)檢測(cè)PDLSCs在大鼠牙周膜內(nèi)的表達(dá)，為其參與OTM提供了新的證詞；隨后使用可控液壓加載裝置，模擬體內(nèi) PDLSCs的受壓環(huán)境，通過(guò)檢測(cè)體外培養(yǎng)的 PDLSCs受壓后成骨分化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化，探討OTM過(guò)程中壓力對(duì)PDLSCs骨向分化能力的影響；最后，本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)檢測(cè)壓力作用下經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)PDLSCs骨向分化能力的調(diào)控，為OTM過(guò)程中細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)及其發(fā)生機(jī)制提供了理論和

5、實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分大鼠OTM模型的研究
　　目的:
　　構(gòu)建大鼠OTM模型，檢測(cè)PDLSCs在大鼠牙周膜內(nèi)的表達(dá)，證實(shí)PDLSCs參與了OTM。
　　方法:
　　按隨機(jī)原則，將大鼠分為4組，包括對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1、3、7d組，每組6只，其中空白對(duì)照組不施加任何壓力裝置，而正畸加力組則以上頜切牙為支抗，用螺旋鎳鈦拉簧拉大鼠右上頜第一磨牙近移。加力完成后取材，HE染色觀察牙周組織形態(tài)學(xué)變化。TRAP染色檢測(cè)壓

6、力側(cè)牙周膜內(nèi)破骨細(xì)胞的數(shù)目變化。免疫組化染色觀察干細(xì)胞標(biāo)記nestin和PDGFRα的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　?。?）HE染色結(jié)果顯示，牙周組織形態(tài)學(xué)變化具有時(shí)間依賴性，表現(xiàn)為與對(duì)照組相比，隨著加力時(shí)間的增長(zhǎng)，壓力側(cè)牙周膜間隙逐漸縮小，牙槽骨吸收越來(lái)越嚴(yán)重。
　?。?）TRAP染色結(jié)果顯示，大鼠壓力側(cè)牙周膜內(nèi)靠近牙槽骨吸收凹陷處可見破骨細(xì)胞。
　?。?）免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠壓

7、力側(cè)牙周膜內(nèi)nestin與PDGFRα的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。
　　結(jié)論
　　PDLSCs在大鼠牙周膜內(nèi)的數(shù)目增多及分布更廣，表明其參與了OTM。
　　第二部分壓力對(duì)hPDLSCs成骨分化能力的影響
　　目的:
　　使用可控液壓加載裝置，模擬體內(nèi)hPDLSCs的受壓環(huán)境，檢測(cè)受壓后hPDLSCs的成骨相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化，探討壓力對(duì)hPDLSCs骨向分化能力的影響。
　　方法:
　　（1）體外分離培養(yǎng)h

8、PDLSCs，對(duì)其干性和分化能力進(jìn)行鑒定
　?。?）使用壓應(yīng)力加載裝置，對(duì)體外培養(yǎng)的hPDLSCs施加100KPa的靜壓力，分別于加壓處理1h和12h后，收集樣品，檢測(cè)hPDLSCs成骨分化能力的改變。
　　結(jié)果:
　?。?）使用有限稀釋法分離培養(yǎng)的hPDLSCs，克隆形成率為28％。干性鑒定結(jié)果顯示，干細(xì)胞標(biāo)記物CD105、CD29、CD44和stro-1表達(dá)呈陽(yáng)性，而CD34和CD45的表達(dá)呈陰性。ALP染色、茜素

9、紅染色、Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后其成骨分化能力增強(qiáng)；油紅染色、Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后其成脂分化能力增強(qiáng)。
　?。?）當(dāng)100KPa的靜壓力作用1h時(shí)，ALP染色及其活性檢測(cè)結(jié)果顯示，hPDLSCs成骨分化能力增強(qiáng)；Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，hPDLSCs表達(dá)ALP和RUNX2明顯升高。而當(dāng)壓力持續(xù)至12h時(shí)，ALP染色及其活性檢測(cè)結(jié)果顯示，hPDL

10、SCs成骨分化能力降低；Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，ALP和RUNX2表達(dá)量下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　（1）通過(guò)有限稀釋法分離培養(yǎng)的hPDLSCs具有干細(xì)胞特性。
　　（2）適宜的靜壓力在短時(shí)間內(nèi)上調(diào)了hPDLSCs的成骨能力，而長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)則對(duì)其起抑制作用。
　　第三部分經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)PDLSCs成骨分化能力的影響
　　目的:
　　通過(guò)檢測(cè)壓力作用下經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的

11、表達(dá)變化以及調(diào)節(jié)通路后hPDLSCs成骨分化能力的改變，明確經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)hPDLSCs成骨分化能力的影響。
　　方法:
　?。?）組織切片免疫組化染色，觀察大鼠壓力側(cè)牙周膜內(nèi)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路效應(yīng)分子active-β-catenin的表達(dá)變化。
　?。?）Western blot和RT-PCR檢測(cè)100KPa/1h和100KPa/12h的靜壓力作用下經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化。
　?。?）在10

12、0KPa/1h和100KPa/12h的壓力條件下，分別使用wnt3a和DKK1調(diào)節(jié)經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路后，ALP染色及其活性檢測(cè)觀察 hPDLSCs成骨分化能力的改變，Western blot和RT-PCR檢測(cè)hPDLSCs表達(dá)ALP和RUNX2的變化。
　　結(jié)果:
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示，隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠壓力側(cè)牙周膜中active-β-catenin的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。
　?。?）Western blot結(jié)

13、果顯示，當(dāng)100KPa的靜壓力作用1h后，hPDLSCs表達(dá)P-GSK-3β、active-β-catenin和β-catenin下降，而GSK-3β的表達(dá)量上升；當(dāng)壓力持續(xù)到12h時(shí)，檢測(cè)結(jié)果與上述相反。RT-PCR結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）靜壓力作用下，上調(diào)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路后，ALP染色及其活性檢測(cè)結(jié)果顯示，hPDLSCs的成骨能力被抑制；Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，ALP和RUNX2的表達(dá)下降。而抑