ERK通路調(diào)控正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)牙周膜干細(xì)胞內(nèi)皮向分化的機(jī)制研究.pdf

1、牙周炎作為常見(jiàn)的口腔慢性炎癥性疾病，常導(dǎo)致牙周支持組織破壞，進(jìn)而造成牙齒脫落，并可以影響一些全身性疾病的發(fā)病和病程。但是至今對(duì)于牙周炎發(fā)病及病程發(fā)展的機(jī)制尚不完全明確。牙周炎在發(fā)病過(guò)程中，炎性組織可以產(chǎn)生血管生成因子和炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)皮向分化，最終形成大量新生血管?，F(xiàn)已證實(shí)牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化并形成血管的能力，但是對(duì)于調(diào)控其分化的胞內(nèi)機(jī)制尚

2、不完全明確。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)鍵通路之一，在真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，影響著細(xì)胞分裂增殖、分化、自噬、凋亡等多種生理病理行為。ERK1/2是ERK通路的關(guān)鍵蛋白，ERK1/2的磷酸化和去磷酸化是將分子信號(hào)從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)的關(guān)鍵步驟。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外基質(zhì)的生長(zhǎng)因子刺激后， ERK1/2通過(guò)一系列酶反應(yīng)被激活，從而對(duì)細(xì)胞的活動(dòng)進(jìn)行調(diào)

3、節(jié)。
　　牙周膜干細(xì)胞在不同局部微環(huán)境下的多向分化能力是否發(fā)生變化、如何變化、受到什么因素或信號(hào)的調(diào)節(jié)、對(duì)生物學(xué)功能有何影響等已經(jīng)有一些研究報(bào)道，但主要集中于成骨分化方向；對(duì)其他方向分化可能及影響程度等尚少有研究。
　　本課題針對(duì)于此，使用TNF-α模擬炎癥微環(huán)境，觀察ERK通路的活化對(duì)正常及炎癥微環(huán)境下PDLSCs內(nèi)皮向分化的調(diào)控作用；為進(jìn)一步深入探討不同分化方向能力變化和選擇性調(diào)控奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　1.研究目的：

4、
　　探討正常及炎癥微環(huán)境下，ERK通路在PDLSCs內(nèi)皮向分化中的作用，為PDLSCs分化調(diào)控應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　1.1.體外培養(yǎng)和鑒定人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）。使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）聯(lián)合誘導(dǎo)PDLSCs內(nèi)皮向分化，檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)

5、皮向分化相關(guān)的相關(guān)指標(biāo)水平，建立PDLSCs內(nèi)皮向分化模型。在體外使用炎性因子TNF-α模擬體內(nèi)炎癥微環(huán)境對(duì)PDLSCs進(jìn)行刺激，并檢測(cè)內(nèi)皮向分化相關(guān)指標(biāo)，建立炎癥微環(huán)境內(nèi)皮向分化模型。
　　1.2.按所建立正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)皮向分化模型，對(duì)PDLSCs進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖情況和內(nèi)皮向分化相關(guān)指標(biāo)水平。比較兩種不同誘導(dǎo)環(huán)境對(duì)PDLSCs增殖和內(nèi)皮向分化的影響。
　　1.3.按照模型誘導(dǎo)PDLSCs分化，觀察

6、細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平隨不同時(shí)間點(diǎn)和誘導(dǎo)方法而發(fā)生的改變。
　　1.4.阻斷ERK1/2磷酸化過(guò)程后，在正常及炎癥微環(huán)境對(duì)PDLSCs進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖情況和分化相關(guān)指標(biāo)水平。比較阻斷前后細(xì)胞分化能力的改變，明確ERK通路對(duì)PDLSCs內(nèi)皮向分化的作用。
　　2.研究方法：
　　2.1.采用酶消化法獲取原代牙周膜細(xì)胞，單細(xì)胞克隆純化細(xì)胞。克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)

7、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物的陽(yáng)性率，成骨及成脂誘導(dǎo)定性檢測(cè)細(xì)胞多向分化能力。
　　2.2.對(duì)兩種誘導(dǎo)環(huán)境下的PDLSCs進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)， Real-time PCR檢測(cè)PDLSCs誘導(dǎo)后內(nèi)皮相關(guān)基因CD31、VEGF及VE-cadherin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞中CD31+和VE-cadherin+細(xì)胞比例。MatrigelTM基質(zhì)膠內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)，并拍照統(tǒng)計(jì)管腔形成數(shù)目、分支節(jié)點(diǎn)數(shù)及管腔長(zhǎng)度。根據(jù)這些

8、指標(biāo)比較正常及炎癥微環(huán)境PDLSCs內(nèi)皮向分化能力的差異。
　　2.3.使用U0126作為ERK1/2磷酸化阻斷劑，溶劑DMSO作為陰性對(duì)照。提取PDLSCs誘導(dǎo)后0h、1h、3h、6h、12h的蛋白，Western blotting檢測(cè)ERK1/2磷酸化水平。正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)誘導(dǎo)以及加入U(xiǎn)0126后分化誘導(dǎo)1h，提取蛋白檢測(cè)ERK1/2磷酸化水平。
　　2.4.加入U(xiǎn)0126阻斷ERK1/2磷酸化過(guò)程，正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)

9、對(duì)PDLSCs進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，DMSO作為陰性對(duì)照，Real-time PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后PDLSCs內(nèi)皮相關(guān)基因CD31、VEGF及VE-cadherin mRNA轉(zhuǎn)錄水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞中CD31+和VE-cadherin+細(xì)胞比例；MatrigelTM基質(zhì)膠內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)，并拍照統(tǒng)計(jì)管腔形成數(shù)目、分支節(jié)點(diǎn)數(shù)及管腔長(zhǎng)度并進(jìn)行比較。比較阻斷ERK1/2磷酸化過(guò)程對(duì)PDLSCs在兩種條件下內(nèi)皮向分化能力的差異。

10、>　　3.研究結(jié)果：
　　3.1.原代培養(yǎng)純化后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，呈放射狀排列，長(zhǎng)軸之間近于平行。鑒定細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞具有克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示純化所得細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物；成骨及成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞具有成骨和成脂分化潛能。
　　3.2.PDLSCs內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)后檢測(cè)內(nèi)皮向分化指標(biāo)，Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對(duì)于炎癥微環(huán)境中誘導(dǎo)分化的PDLSCs，VE-cadheri

11、n和VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平、CD31+和VE-cadherin+細(xì)胞比例顯著高于正常環(huán)境培養(yǎng)條件下，管腔形成能力也明顯高于正常環(huán)境培養(yǎng)條件下內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的PDLSCs。
　　3.3.Western blotting顯示PDLSCs經(jīng)過(guò)內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，ERK1/2磷酸化水平升高，其中1h和3h顯著高于誘導(dǎo)前。選取誘導(dǎo)后1h這一時(shí)間點(diǎn)，分別在正常及炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)和加入U(xiǎn)0126后進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境中誘導(dǎo)的p-ER

12、K1/2水平高于正常條件下，而U0126可以阻斷誘導(dǎo)引起的ERK1/2的磷酸化過(guò)程。
　　3.4.Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，加入U(xiǎn)0126后，PDLSCs的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平以及管腔形成能力均明顯降低，表明阻斷了ERK1/2磷酸化過(guò)程會(huì)抑制PDLSCs的內(nèi)皮向分化過(guò)程。但炎癥微環(huán)境中阻斷ERK1/2磷酸化對(duì)內(nèi)皮向分化過(guò)程的抑制并不完全。
　　結(jié)論：
　　PDLSCs被VEG