Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)的基因調(diào)控毛囊干細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、背景和目的：
　　毛囊干細(xì)胞(Hair follicle stem cells，HFSCs)被選為種子細(xì)胞用于構(gòu)建組織工程皮膚以修復(fù)臨床燒傷、創(chuàng)傷、慢性潰瘍等皮膚缺失已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。毛囊是皮膚的重要附屬器官，從內(nèi)向外依次由毛干、內(nèi)根鞘和外根鞘組成。毛囊隆突部位于外根鞘近表皮端，皮脂腺下方豎毛肌附著處，此處的細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出干細(xì)胞的特性，即可自我復(fù)制、慢周期性和具有多向分化潛能。目前已經(jīng)得到證實(shí)，隆突部的這一群特殊的細(xì)胞為

2、毛囊干細(xì)胞。毛囊干細(xì)胞具有多向分化遷移能力，不僅能向上分化并遷移參與表皮更新和皮脂腺維持，而且能向下端毛球部分化并遷移參與形成毛囊。毛囊干細(xì)胞分化傾向的不同是由多種因素共同決定的，不僅有細(xì)胞內(nèi)部分子及基因的調(diào)控，也有外來信號(hào)及微環(huán)境壁龕的協(xié)同作用，更有多條信號(hào)通路傳導(dǎo)分化“命令”。在眾多科研工作者的共同努力下發(fā)現(xiàn)，毛囊干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)在調(diào)控其增殖、分化中起到重要作用。
　　Wnt/

3、β-catenin信號(hào)通路在全身幾乎所有的細(xì)胞中都存在，細(xì)胞受到刺激后釋放Wnt蛋白，激活下游一系列大分子信號(hào)活性物質(zhì)，最終導(dǎo)致基因表達(dá)改變，是誘導(dǎo)細(xì)胞分化和增殖的一條分子級(jí)聯(lián)通路，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中，這條通路也起到關(guān)鍵性的作用。在HFSCs中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后會(huì)引起β-catenin在胞漿內(nèi)的堆積，隨之轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核中，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Tcf3/Lefl結(jié)合，激活下游靶基因c-myc、cyclin D1等的轉(zhuǎn)錄

4、，促進(jìn)毛囊干細(xì)胞定向分化。近年來有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外來干預(yù)因子氯化鋰(LiCl)可抑制Wnt信號(hào)通路中β-catenin的降解，使之在細(xì)胞質(zhì)中聚集，激活下游通路，影響毛囊干細(xì)胞分化的表型，但對(duì)于LiCl調(diào)節(jié)HFSCs分化的分子機(jī)制研究較少，且局限于在細(xì)胞質(zhì)中作用的研究。本課題選用了氯化鋰激活Wnt信號(hào)通路，探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在人HFSCs向毛囊形成細(xì)胞或表皮細(xì)胞定向分化中的作用及與其他信號(hào)因子的相互關(guān)系，尤其是細(xì)胞核內(nèi)的

5、分子水平改變，以及藥物控釋系統(tǒng)的建立和在組織工程皮膚中的應(yīng)用。
　　方法：
　　1.頭皮組織采用改進(jìn)的毛囊隆突部獲取方法及兩步酶消化后，將帶有隆突部的毛發(fā)剪成泥狀，Ⅳ型膠原差速貼壁法獲取毛囊干細(xì)胞。使用免疫熒光染色法對(duì)毛囊干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。以500個(gè)/孔(2.5×103/m1)、1000個(gè)/孔(5×103/m1)、2000個(gè)/孔(1×104/m1)、3000個(gè)/孔(1.5×104/m1)、5000個(gè)/孔(2.5×104/m1)

6、接種于96孔培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，采用MTT法描繪其生長(zhǎng)曲線，觀察各密度培養(yǎng)的HFSCs在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖效應(yīng)，篩選出體外最佳的HFSCs傳代培養(yǎng)密度。
　　2.選用0、0.1、1、5、10、20、40、100mM/l的氯化鋰誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞分化，觀察毛囊干細(xì)胞的生存狀態(tài)，確定氯化鋰的毒性作用范圍；選用0、5、10mM/l氯化鋰作用于毛囊干細(xì)胞，MTT法對(duì)比分析各組對(duì)細(xì)胞增殖效應(yīng)；LiCl終濃度分別為0、0.1、1、10、50

7、、100、200、400μg/ml作用于毛囊干細(xì)胞，檢測(cè)氯化鋰的毒性，并探索促HFSCs分化的最佳LiCl濃度；采用real-time PCR技術(shù)定量檢測(cè)0、5、10mmol/ml LiCl干預(yù)毛囊干細(xì)胞5d后Wnt信號(hào)通路中生物大分子：β-catenin、GSK-3β、Tcf3、c-myc和cyclin D1的mRNA水平，探討LiCl誘導(dǎo)HFSCs分化過程中，LiCl的不同濃度對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑及其相關(guān)信號(hào)因子的表

8、達(dá)的影響和相互作用。
　　3.LiCl-PLGA納米微球的制備：選用聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)作為微囊敷料，荷載適當(dāng)濃度的氯化鋰，采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備載有氯化鋰的納米微囊。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，選用異體脫細(xì)胞真皮(ADM)為支架材料，以擴(kuò)增培養(yǎng)的HFSCs為種子細(xì)胞接種于ADM表皮面，成纖維細(xì)胞接種于ADM真皮面，構(gòu)建組織工程皮膚。采用5mM/l的LiCl干預(yù)構(gòu)建的組織工程皮膚，培養(yǎng)5d后切片行HE染色、免疫熒光染色和

9、免疫組織化學(xué)染色，觀察種子細(xì)胞在ADM上的生長(zhǎng)及分化情況，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定良好基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　1.從人頭皮成功分離培養(yǎng)出HFSCs，在體外經(jīng)多次傳代后仍具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，當(dāng)HFSCs接種密度為1x104ml時(shí)，細(xì)胞增殖速度最快，擴(kuò)展能力強(qiáng)，其生長(zhǎng)曲線呈典型的S型。
　　2.隨LiCl濃度升高，細(xì)胞增殖效應(yīng)減弱。含有LiCl的K-SFM條件培養(yǎng)基中HFSCs形態(tài)改變明顯，各組間有明顯差別，LiCl>

10、10mmol/L時(shí)分化比例高。LiCl誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的同時(shí)還有其一定的細(xì)胞毒性，濃度大于200μg/ml(約5mmol/L)時(shí)明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在HFSCs分化過程中，LiC l可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，當(dāng)濃度為5mM/l時(shí)促使β-catenin及其拮抗物G SK3β、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Tcf3、下游基因c-myc、cyclin D1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，濃度為10 mM/l時(shí)除cyclin D1轉(zhuǎn)錄仍上調(diào)外，

11、其余基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)。
　　3.掃描電鏡觀察細(xì)胞在PLGA-ADM材料上生長(zhǎng)良好，分泌的胞外基質(zhì)豐富，并隨時(shí)間進(jìn)展，細(xì)胞逐漸融合，細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸增多。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)H FSCs生長(zhǎng)狀態(tài)良好，單層排列分布于ADM表皮面上，LiCl干預(yù)組表皮面有毛囊樣小凹形成，成纖維細(xì)胞與ADM真皮面貼附緊密，能分泌胞外基質(zhì)形成連續(xù)細(xì)胞層包繞ADM。
　　結(jié)論：
　　1.我們改進(jìn)的培養(yǎng)方法能簡(jiǎn)便快捷的獲取人HFSCs，且得到的人HFSC

12、s在體外有較強(qiáng)的增殖及傳代能力，1×104/ml接種密度是促進(jìn)HFSCs增殖的最佳密度。
　　2.LiCl促HFSCs分化明顯，對(duì)HFSCs的干預(yù)有臨界毒性濃度，當(dāng)濃度大于200μg/ml時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受到明顯抑制，同時(shí)這一濃度也是促HFSCs分化的最佳濃度。LiCl促HFSCs分化作用可能與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路、通路下游各因子轉(zhuǎn)錄上調(diào)相關(guān)，Tcf3在維持細(xì)胞未分化狀態(tài)中發(fā)揮了一定的作用，cyclin D1的轉(zhuǎn)