TGF—β-Activin信號(hào)通路在干細(xì)胞定向分化過(guò)程中的作用.pdf

1、細(xì)胞外信號(hào)TGF-β家族在多種生物的早期胚胎的胚層建立和細(xì)胞分化中起重要作用.研究發(fā)現(xiàn)它們可能參與了人類(lèi)胚胎干細(xì)胞多能性的維持和分化等調(diào)控過(guò)程.本論文通過(guò)抑制TFGF-β家族中的TFGF-β/Activin信號(hào)通路,誘導(dǎo)人類(lèi)胚胎干細(xì)胞分化,對(duì)其在人類(lèi)胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中的作用進(jìn)行了研究.此外我們還初步獲得了TFGF-β/Acfivin信號(hào)通路下游重要目的基因Nanog條件基因敲除以后,發(fā)生同源重組的小鼠胚胎干細(xì)胞和C57B/6J成年小鼠

2、不同組織器官中Nanog基因的表達(dá)情況,為Nanog條件基因敲除小鼠模型的構(gòu)建奠定基礎(chǔ).本文在胚胎干細(xì)胞和成體組織兩個(gè)不同的層次上研究了TGF-β/Activin信號(hào)對(duì)于干細(xì)胞多能性的維持和定向分化過(guò)程中的調(diào)控作用. SB-431542主要是通過(guò)抑制TFGF-β1 activin receptor-like kinases(ALKs)中的ALK4、ALK5、ALK7來(lái)抑制.TGF-β/Activin信號(hào)通路的.本論文主要是用分別

3、含0,1,10μM SB-431542的CM(條件性培養(yǎng)液)培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞系H1細(xì)胞4天、6天、8天、10天和12天.收集各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞樣品,然后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析各個(gè)胚層和組織器官標(biāo)志物的表達(dá),以分析人類(lèi)胚胎干細(xì)胞分化的方向;同時(shí)檢測(cè)其它重要信號(hào)通路例如FGF,Wnt和BMP等通路中相關(guān)基因的表達(dá)變化.結(jié)果顯示TGF-β/Acfivin信號(hào)通路被抑制后,人類(lèi)胚胎干細(xì)胞失去多能性,并高表達(dá)GCM-1,CGA和H

4、andl等滋養(yǎng)外胚層的標(biāo)志基因,而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和SB-431542濃度的增加,這些基因的表達(dá)具有更加顯著的上調(diào)趨勢(shì).但是中胚層,外胚層和內(nèi)胚層的標(biāo)志物表達(dá)不顯著,這表明抑制TGF-β/Acfivin信號(hào)通路,人類(lèi)胚胎干細(xì)胞特異的向滋養(yǎng)外胚層分化.另外我們還檢測(cè)了0,100-M SB-431542處理10天后人類(lèi)胚胎干細(xì)胞FGF,Wnt和BMP信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá),結(jié)果顯示.FGF2,FGF4,FGF8,BMP7和Wnt3的表達(dá)都下

5、調(diào),BMP2和BMP4表達(dá)變化不顯著.結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前的結(jié)果,推測(cè).FGF-β/Activin信號(hào)通路可能誘導(dǎo)FGF2,FGF4,FGF8,BMP7和Wnt3的表達(dá). 此外,為了在不同層次上研究TFGF-β/Activin信號(hào)對(duì)于干細(xì)胞多能性的維持和定向分化的調(diào)控機(jī)理,我們還應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建將Nanog第二個(gè)外顯子置換成Loxp-FRT-Neo-FRT-外顯子2-Loxp的同源重組載體,通過(guò)電轉(zhuǎn),將線(xiàn)性化的載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干

6、細(xì)胞中進(jìn)行同源重組,用藥物G418篩選出抗G418的攜帶有NeD基因的小鼠胚胎干細(xì)胞系,最后通過(guò)PCR初步篩選出同源重組的小鼠胚胎干細(xì)胞系.同時(shí)我們?cè)敿?xì)分析了Nanog基因在成年C57B/6J小鼠各個(gè)器官的表達(dá).RT-PCR結(jié)果顯示在成年C57B/6J小鼠中Nanog基因不僅在胚胎干細(xì)胞和生殖系統(tǒng)中表達(dá),而且在成年小鼠的小腦,腎臟,肺和大腦表達(dá). 本文對(duì)TGF-β/Activin信號(hào)通路在人胚胎干細(xì)胞分化中的影響有了初步的研究,