轉(zhuǎn)錄因子CREB在根尖牙乳頭干細(xì)胞定向分化中的作用.pdf

1、近年來，干細(xì)胞生物學(xué)和組織工程學(xué)發(fā)展迅速，這促進(jìn)了再生性醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。再生性醫(yī)學(xué)的目的是創(chuàng)造功能性、有活力的組織，修復(fù)或取代受損的組織。在牙體牙髓科中，根尖牙乳頭干細(xì)胞( SCAPs，stem cells from the apical papilla)是研究的熱點(diǎn)，它存在于未發(fā)育完全的恒牙根尖周組織中，是具有高度增生自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，被認(rèn)為是牙根部成牙本質(zhì)細(xì)胞的來源，最終形成牙根部牙本質(zhì)。SCAPs的存在解釋了一些

2、被感染的年輕恒牙經(jīng)過適當(dāng)?shù)南咎幚砗?，牙根仍能繼續(xù)發(fā)育的現(xiàn)象。
　　cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路可以決定間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化潛力。作為該通路的下游信號(hào)，CREB（cAMP responsive element-binding protein）起了關(guān)鍵作用，它通過附著于cAMP（cyclic Adenosine3',5'-monophosphate）反應(yīng)基因的保守序列而發(fā)揮作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類磨牙成牙本質(zhì)細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞

3、的細(xì)胞核內(nèi)， CREB表達(dá)明顯，而抑制 CREB后，小鼠的軟骨內(nèi)骨形成減少。此外，在許多與礦化過程相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，含有轉(zhuǎn)錄因子 CREB在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)CRE，如骨鈣素（OCN，osteocalcin），骨涎蛋白（BSP，bone sialoprotein）等。提示CREB在生物礦化的過程中起了重要作用，然而，在SCAPs中，CREB對(duì)于成牙本質(zhì)/成骨分化的作用還未完全確定。
　　目的：通過慢病毒轉(zhuǎn)染人根尖牙乳頭干細(xì)胞

4、（SCAPs，stem cells from the apical papilla），改變轉(zhuǎn)錄因子CREB（cAMP-responsive element binding protein）在SCAPs中的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)SCAPs成牙本質(zhì)/成骨向分化的影響，從而探討CREB定向調(diào)控根尖牙乳頭干細(xì)胞分化的分子機(jī)制。
　　方法：分離培養(yǎng)人根尖牙乳頭干細(xì)胞；采用有限稀釋法獲得克隆化細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞多向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鑒定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的組織學(xué)來

5、源；分別構(gòu)建慢病毒載體介導(dǎo)的CREB基因過表達(dá)和沉默的根尖牙乳頭干細(xì)胞；實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率。預(yù)實(shí)驗(yàn)確立各組慢病毒MOI（Multiply of Infection）值及最佳轉(zhuǎn)染條件。將細(xì)胞分組為空白對(duì)照組、陰性病毒對(duì)照組、過表達(dá)組、沉默組。將空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組、CREB過表達(dá)/沉默組礦化誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色觀察比較礦化結(jié)節(jié)形成的量，并半定量分析；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)礦化誘導(dǎo)1、2、3周時(shí)，各組

6、細(xì)胞的堿性磷酸酶（alkaline phosphateasea, ALP），Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ, Col-Ⅰ），runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)，骨鈣素（osteocalcin, OCN）， osterix(OSX)的mRNA表達(dá)；對(duì)各組細(xì)胞礦化誘導(dǎo)3周后，Western Blot檢測(cè)成牙本質(zhì)特異性蛋白DSP（dentin sialoprotein）及成骨分化標(biāo)志物RUNX2的表達(dá)，并進(jìn)行蛋白半定量分析。

7、　　結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)和干細(xì)胞多向分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為SCAPs。實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測(cè)顯示慢病毒轉(zhuǎn)染SCAPs后能夠有效改變目的基因CREB表達(dá)，結(jié)合熒光顯微鏡觀察說明慢病毒具有很高的轉(zhuǎn)染效率，且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響。茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)半定量分析顯示，礦化誘導(dǎo)2周后，CREB過表達(dá)組形成鈣結(jié)節(jié)能力增強(qiáng)；礦化誘導(dǎo)1、2、3周，CREB過表達(dá)組中的礦化標(biāo)志物ALP，Col-Ⅰ，RUNX2，OCN，OSX的mR

8、NA在各時(shí)間點(diǎn)幾乎均上升；Western Blot檢測(cè)礦化誘導(dǎo)3周時(shí)的細(xì)胞示，CREB過表達(dá)組 DSP，RUNX2蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。而CREB沉默組形成鈣結(jié)節(jié)能力則減弱（P<0.05），且在礦化誘導(dǎo)4、7天時(shí)檢測(cè)，礦化基因的mRNA均有不同程度的降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：在SCAPs礦化誘導(dǎo)過程中，過表達(dá)CREB促進(jìn)SCAPs向成牙/成骨細(xì)胞分化，而沉默CREB則發(fā)揮相反作用，提示CREB可能促進(jìn)SCAPs的定