Wnt5a對根尖牙乳頭干細胞體外成骨、成脂分化的影響.pdf

1、目的：通過建立Wnt5a過表達和沉默的根尖牙乳頭干細胞（SCAP）細胞系，檢測其相關(guān)成骨及成脂因子的表達，探討 Wnt5a對 SCAP體外成骨、成脂分化的影響，為Wnt5a調(diào)控SCAP的生物學(xué)作用提供一定的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　通過體外酶消化法及有限稀釋法純化培養(yǎng)人根尖牙乳頭干細胞（SCAP），并進行鑒定。構(gòu)建Wnt5a過表達和沉默的慢病毒載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SCAP，獲得Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞系，并

2、以嘌呤霉素篩選；qRT-PCR檢測SCAP中Wnt5a的mRNA表達，Western Blot檢測Wnt5a的蛋白表達。將Wnt5a過表達SCAP和Wnt5a沉默SCAP以及各自的空載體對照組進行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別在2周、3周和4周終止誘導(dǎo)，提取細胞RNA，qRT-PCR檢測ALP、BSP、DSPP、OCN的mRNA表達；提取細胞總蛋白，Western Blot檢測ALP、BSP、DSPP、OCN的蛋白表達。將Wnt5a過表達SCA

3、P和Wnt5a沉默SCAP以及各自的空載體對照組進行體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，提取細胞RNA，qRT-PCR檢測PPAR-γ的mRNA表達；提取細胞總蛋白，Western Blot檢測PPAR-γ的蛋白表達。
　　本實驗相關(guān)數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1. Wnt5a慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了SCAP，轉(zhuǎn)染率近90％；Wnt5a過表達組與空載體組相比其mRNA及蛋白表達顯著升高（P<0.05），Wn

4、t5a沉默組顯著降低（P<0.05）。建立了Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞系。
　　2. SCAP成骨相關(guān)礦化因子的表達：
　?。?）ALP：礦化誘導(dǎo)2周，Wnt5a過表達組與對照組比較ALP的mRNA表達量降低（P<0.05），蛋白表達量升高（P<0.05）；Wnt5a沉默組與對照組比較ALP的mRNA表達量差異不明顯（P>0.05），蛋白表達量降低（P<0.05）；Wnt5a過表達組mRNA及蛋白表達均高于沉默組（

5、P<0.05）。誘導(dǎo)3周及4周，與對照組相比，Wnt5a過表達組ALP的mRNA及蛋白表達量均升高（P<0.05），Wnt5a沉默組均降低（P<0.05）；Wnt5a過表達組mRNA及蛋白表達均高于沉默組（P<0.05）。
　?。?）BSP：礦化誘導(dǎo)2、3、4周，與對照組相比，Wnt5a過表達組BSP的mRNA及蛋白表達量均升高（P<0.05），Wnt5a沉默組表達量均降低（P<0.05）；Wnt5a過表達組BSP的mRNA及蛋白

6、表達均高于沉默組（P<0.05）。
　?。?）DSPP：礦化誘導(dǎo)2周，Wnt5a過表達組與對照組比較DSPP的mRNA及蛋白表達量均升高（P<0.05），Wnt5a沉默組與對照組比較DSPP的mRNA表達量降低（P<0.05），但Wnt5a沉默組未檢測到蛋白表達；Wnt5a過表達組DSPP的mRNA表達高于沉默組（P<0.05）。誘導(dǎo)3周和4周，與對照組相比，Wnt5a過表達組 DSPP的mRNA及蛋白表達量升高（P<0.05），

7、Wnt5a沉默組表達量降低（P<0.05）；Wnt5a過表達組DSPP的mRNA及蛋白表達均高于沉默組（P<0.05）。（4） OCN：礦化誘導(dǎo)2周，Wnt5a過表達組及沉默組與對照組比較OCN的mRNA及蛋白表達量均升高（P<0.05）；Wnt5a過表達組OCN的mRNA及蛋白表達均低于沉默組（P<0.05）。誘導(dǎo)3周及4周，Wnt5a過表達組OCN的mRNA及蛋白表達量高于對照組（P<0.05），Wnt5a沉默組低于對照組（P<0.

8、05）；Wnt5a過表達組OCN的mRNA及蛋白表達均高于沉默組（P<0.05）。
　　3. SCAP相關(guān)成脂因子 PPAR-γ：與對照組相比，Wnt5a過表達組 PPAR-γ的mRNA及蛋白表達量均升高（P<0.05），Wnt5a沉默組均降低（P<0.05），Wnt5a過表達組較沉默組表達量升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞系，轉(zhuǎn)染率近90%。<

9、br>　　2. Wnt5a過表達在體外能夠上調(diào)SCAP細胞礦化因子ALP、BSP、DSPP、OCN表達；Wnt5a沉默則下調(diào)以上因子的表達。以礦化誘導(dǎo)3周及4周變化明顯。
　　3. Wnt5a過表達在體外能夠上調(diào) SCAP細胞成脂因子 PPAR-γ的表達；Wnt5a沉默則下調(diào)其表達。
　　4.本研究條件下，初步證實 Wnt5a對根尖牙乳頭干細胞體外成骨、成脂分化具有促進作用。為牙根發(fā)育的分子機制和將來臨床治療及組織工程利用