機(jī)械牽伸通過Wnt5a、Wnt5b-JNK信號(hào)通路促進(jìn)大鼠肌腱干細(xì)胞成骨分化.pdf

1、背景和目的:
　　肌腱病(Tendinopathy)是骨科常見疾病，常見的肌腱病有跟腱炎、網(wǎng)球肘、岡上肌腱炎等三十余種，職業(yè)運(yùn)動(dòng)員發(fā)生肌腱病往往意味著運(yùn)動(dòng)生涯的終結(jié)，目前對(duì)肌腱病尚無有效的治療方法。肌腱組織中出現(xiàn)異位骨化和脂肪組織是肌腱病的主要病理表現(xiàn)[1]，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為過度使用導(dǎo)致的肌腱損傷是肌腱病的主要致病原因，但其致病機(jī)制不詳。2007年Bi等[2]在肌腱組織中分離出了干細(xì)胞，稱為肌腱干細(xì)胞(Tendon stemcells

2、，TSCs)，TSCs是肌腱細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有多向分化潛能。Gulotta等[3]證實(shí)TSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)相似的生物學(xué)特性，TSCs對(duì)于肌腱細(xì)胞再生及肌腱損傷的修復(fù)起重要作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，TSCs細(xì)胞形態(tài)的改變可以影響其分化方向，對(duì)TSCs施加4％強(qiáng)度的機(jī)械牽伸應(yīng)力，TSC

3、s主要分化為肌腱細(xì)胞，參與肌腱細(xì)胞更新及肌腱組織修復(fù)，在8％強(qiáng)度的機(jī)械牽伸下，TSCs主要分化為非肌腱細(xì)胞（骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞）[4]，然而機(jī)械牽伸引起TSCs發(fā)生成骨分化的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。研究機(jī)械牽伸條件下TSCs向骨細(xì)胞分化的分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)于揭示肌腱病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。
　　我們研究大鼠肌腱來源干細(xì)胞(rat tendon-derived stem cells，rTDSCs)在機(jī)械牽伸應(yīng)力誘導(dǎo)下的成骨

4、分化能力;檢測在機(jī)械牽伸應(yīng)力誘導(dǎo)下非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的Wnt5a、Wnt5b基因及蛋白水平的表達(dá);磷酸化JNK(Phosphorylated JNK，P-JNK)水平;以及Wnt5a，Wnt5b與JNK間的相互調(diào)控關(guān)系;研究機(jī)械牽伸應(yīng)力是否通過Wnt5a/Wnt5b/JNK信號(hào)通路調(diào)控rTDSCs的成骨分化，探究肌腱組織異位骨化的形成機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:rTDSCs干細(xì)胞特性及多向分化能力的鑒定。自大鼠跟腱

5、組織中分離、培養(yǎng)細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)測定細(xì)胞的表面標(biāo)記物:CD31抗體、CD44抗體、CD90抗體、CD34抗體，用免疫熒光法檢測核干細(xì)胞因子抗體(nucleostemin)、Nanog抗體、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4抗體(octarner-binding transcriptionfactor4，Oct-4)。加入干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基做成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，加入普通生長基(growthmedium，GM)作為對(duì)

6、照，成骨誘導(dǎo)21天后提取RNA，用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測成骨基因Runx2、DIX5 mRNA表達(dá)，并做茜素紅染色實(shí)驗(yàn);用干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基做成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，而加入GM作為對(duì)照組，成脂誘導(dǎo)14天后提取RNA，RT-PCR檢測成脂基因PPARγ、ap2 mRNA表達(dá)，并做油紅染色實(shí)驗(yàn);用干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基做成軟骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，在誘導(dǎo)21天后將形成的

7、軟骨團(tuán)塊切片做阿爾新藍(lán)染色。
　　第二部分:檢測rTDSCs經(jīng)單軸機(jī)械牽伸(uniaxial mechanical tension，UMT)誘導(dǎo)后的成骨分化能力。rTDSCs在牽伸頻率為1HZ、牽伸強(qiáng)度為8％的條件下經(jīng)UMT誘導(dǎo)48、60、72h，用RT-PCR檢測成骨基因Runx2，Dlx5，Alpl, Col1a1 mRNA相對(duì)于非牽伸對(duì)照組(non-loading control，NC)的表達(dá)，用免疫印跡法(western

8、blot，WB)測定Runx2蛋白相對(duì)于NC的表達(dá)，并做堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)。
　　第三部分:rTDSCs經(jīng)UMT誘導(dǎo)48、60、72h后檢測Wnt5a、Wnt5b、Ror2、Rac1mRNA相對(duì)于NC的表達(dá)。在UMT誘導(dǎo)48、60h后WB檢測Wnt5a、Wnt5b蛋白相對(duì)于NC的表達(dá)。
　　第四部分:研究Wnt5a及Wnt5b是否調(diào)控UMT誘導(dǎo)的Runx2蛋白表達(dá)。用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，ShRN

9、A）慢病毒分別干擾rTDSCs的Wnt5a及Wnt5b基因，然后rTDSCs經(jīng)UMT誘導(dǎo)60h，WB檢測Runx2蛋白相對(duì)于慢病毒對(duì)照組的表達(dá)。
　　第五部分:分別用4％、8％強(qiáng)度的UMT誘導(dǎo)rTDSCs24h，用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色法檢測rTDSCs的細(xì)胞骨架改變。rTDSCs經(jīng)UMT誘導(dǎo)48、60h后檢測P-JNK水平。UMT誘導(dǎo)前30min，在rTDSCs培養(yǎng)基中分別加入JNK興奮劑茴香霉素(anisomycin，AM)、J

10、NK抑制劑SP600125，UMT誘導(dǎo)60h后WB檢測Runx2蛋白相對(duì)于未加藥物干預(yù)組的表達(dá)。分別用互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)過表達(dá)rTDSCs的JNK基因、shRNA干擾rTDSCs的JNK基因，然后施加UMT誘導(dǎo)，進(jìn)一步證實(shí)JNK對(duì)UMT誘導(dǎo)的rTDSCs成骨分化具有調(diào)控作用。
　　第六部分:分別用shRNA干擾rTDSCs的Wnt5a、Wnt5b基因，施加UMT誘導(dǎo)后同時(shí)檢測P-JNK水平和Runx2蛋白表達(dá)，研究Wnt

11、5a、Wnt5b是否對(duì)JNK有調(diào)控作用;證實(shí)UMT通過Wnt5a/Wnt5b/JNK信號(hào)通路促進(jìn)rTDSCs的成骨分化。
　　結(jié)果:
　　第一部分:在大鼠跟腱組織中分離、培養(yǎng)細(xì)胞，流式細(xì)胞分析表明細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90抗體陽性，免疫熒光檢測表明核干細(xì)胞因子抗體、Nanog抗體、Oct-4抗體陽性。加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組的成骨基因Runx2、DIX5 mRNA表達(dá)較GM組明顯升高，成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色陽性;加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基組的

12、成脂基因PPARγ、ap2 mRNA表達(dá)較GM組明顯升高，油紅染色陽性;細(xì)胞經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)21天后形成軟骨團(tuán)塊，阿爾新藍(lán)染色陽性。
　　第二部分:rTDSCs經(jīng)UMT誘導(dǎo)48、60、72h后成骨基因Runx2，Dlx5，Alpl, Col1a1mRNA表達(dá)較NC組高，Runx2蛋白水平也較NC組高。rTDSCs經(jīng)UMT誘導(dǎo)72h后ALP染色陽性。
　　第三部分:rTDSCs經(jīng)UMT誘導(dǎo)48、60、72h后Wnt5a、Wnt5b

13、、Ror2、Rac1 mRNA表達(dá)相對(duì)于NC升高，WB檢測Wnt5a、Wnt5b在UMT誘導(dǎo)48、60h的蛋白表達(dá)相對(duì)于NC組升高。
　　第四部分:用shRNA干擾Wnt5a、Wnt5b基因，經(jīng)UMT誘導(dǎo)60h后提取蛋白做WB檢測，結(jié)果Runx2蛋白表達(dá)較慢病毒對(duì)照組下降。
　　第五部分:羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色顯示，rTDSCs經(jīng)UMT誘導(dǎo)后細(xì)胞骨架發(fā)生不可逆改變，UMT可上調(diào)P-JNK水平（相對(duì)于NC組），JNK興奮劑AM及

14、抑制劑SP600125分別促進(jìn)及抑制UMT誘導(dǎo)的Runx2 mRNA及蛋白表達(dá)。用cDNA及shRNA干擾JNK基因，分別促進(jìn)及抑制UMT誘導(dǎo)的Runx2表達(dá)。
　　第六部分:shRNA干擾rTDSCs的Wnt5a、Wnt5b基因可抑制UMT誘導(dǎo)的Runx2蛋白及P-JNK表達(dá)，Wnt5a、Wnt5b shRNA對(duì)UMT誘導(dǎo)的Runx2抑制作用可通過JNK興奮劑AM解救。
　　結(jié)論:
　　第一部分:從大鼠跟腱分離、培養(yǎng)

15、的細(xì)胞采用FCM及免疫熒光檢測具有干細(xì)胞的特性，并且這種細(xì)胞具有向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞軟骨細(xì)胞分化的能力。
　　第二部分:rTDSCs經(jīng)UMT誘導(dǎo)后Runx2的mRNA及蛋白水平均較NC組升高，ALP染色陽性，UMT可以誘導(dǎo)rTDSCs成骨分化。
　　第三部分:rTDSCs經(jīng)UMT后Wnt5a、Wnt5b高表達(dá)，表現(xiàn)為Wnt5a、Wnt5b的mRNA及蛋白表達(dá)較NC組升高。
　　第四部分:非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的Wnt5a