雌二醇通過Wnt信號通路調節(jié)大鼠BMSCs成骨分化機制研究.pdf

1、目的：觀察不同濃度17β-雌二醇對大鼠BMSCs成骨分化的影響，并分析成骨分化過程中經典Wnt信號通路相關信號轉導分子的表達差異，探索17β-雌二醇通過Wnt/β-catenin信號通路調節(jié)大鼠BMSCs成骨分化的作用機制，為臨床應用雌激素或SERMs治療PMOP提供理論依據。
　　方法：應用全骨髓培養(yǎng)法分離4周齡雄性SD大鼠雙下肢的骨髓單個核細胞，通過多次換液及傳代時控制胰酶消化時間純化 BMSCs；利用 BMSCs的三個特性對

2、其進行鑒定，①貼壁特性；②多向分化潛能：對P2代細胞分別進行成骨、成脂誘導并設空白對照，每3天全量換液，于成骨誘導第7天進行ALP染色，成骨誘導第21天進行Alizarin Red S染色，成脂誘導14天進行Oil Red O染色，觀察其分化能力；③利用流式細胞儀對細胞表面標志物進行檢測：CD34、CD44、CD45、CD105。將鑒定成功的大鼠BMSCs接種于多個6孔板中，進行分組培養(yǎng)，分別為0、10-5、10-6、10-7、10-8

3、、10-9 mol/L組，待每孔細胞達到約80％融合，以相應梯度濃度17β-雌二醇處理各組細胞，DMSO處理作為對照組，同時對各組進行成骨誘導，每3天全量換液，于成骨誘導第7天進行ALP染色并進行ALP定量分析，成骨誘導第7天分別提取各組細胞總蛋白，利用Western blot檢測各組細胞Wnt10b、β-catenin、LRP5表達量，成骨誘導第21天進行Alizarin Red S染色。
　　結果：利用全骨髓培養(yǎng)法分離出的大鼠

4、骨髓中的單個核細胞形態(tài)良好，增殖能力強；通過多次換液及傳代時控制胰酶消化時間可純化BMSCs，P2代細胞純度可達95%；對P2代細胞分別進行成骨誘導和成脂誘導，經鑒定BMSCs可向成骨細胞及脂肪細胞分化；利用流式細胞術鑒定P2代細胞，證實所得細胞為間充質來源且均一性較高；對 P2代細胞進行成骨誘導的同時用梯度濃度（0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L）的17β-雌二醇進行處理，成骨誘導7天后ALP染色及定量分

5、析顯示，隨著17β-雌二醇濃度的增加，ALP表達量逐漸增加，且活性增強，其中10-5 mol/L組活性最強，各處理組與空白對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義；成骨誘導第7天，對各組目標蛋白表達量進行Western blot檢測顯示：Wnt10b、β-catenin表達量隨著17β-雌二醇濃度的增加而逐漸增加，10-5 mol/L組最高，LRP5各組表達量無明顯差異；成骨誘導第21天Alizarin Red S染色結果顯示：各組紅褐色礦化結節(jié)

6、的數(shù)量亦隨著17β-雌二醇濃度的增高而逐漸增加。
　　結論：通過全骨髓培養(yǎng)法可分離篩選出純度高、均一性好、增殖能力強的BMSCs；BMSCs在特定的誘導條件下可向成骨細胞及脂肪細胞分化，具有多向分化潛能；體外成骨誘導培養(yǎng)條件下，雌激素可濃度依賴性的促進大鼠BMSCs成骨分化，參與成骨細胞的分化成熟，并且此效應可能是通過上調經典 Wnt信號通路中Wnt10b及β-catenin的表達實現(xiàn)的，而雌激素對經典Wnt信號通路中膜受體LRP