PEMF通過PPARγ-Axin2-Wnt信號軸調(diào)節(jié)GIOP大鼠骨髓脂質(zhì)代謝及其影響骨代謝的機(jī)制研究.pdf

1、長期使用糖皮質(zhì)激素（GCs）可導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，例如骨量減少、骨密度降低而最終引起的糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥（GIOP）。GIOP是最常見的一類繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。大約30％-50%接受GCs治療至少1年的患者患有GIOP，并且其發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)高，即使輕微的損傷后也會發(fā)生脊柱、髖骨和肋骨的骨折。GIOP是嚴(yán)重影響長期使用GCs患者生活質(zhì)量的不良因素。因此，GIOP的防治具有重要的臨床意義。
　　針對GIOP病因進(jìn)行干預(yù)治療才

2、能取得最好的療效。GIOP的發(fā)病機(jī)制與年齡、雌激素缺乏、制動等因素引起的骨質(zhì)疏松癥（OP）不同。GCs直接作用骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs），誘導(dǎo)其分化成脂肪細(xì)胞并導(dǎo)致骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞堆積，引起骨髓脂質(zhì)代謝紊亂，嚴(yán)重影響成骨細(xì)胞分化，骨形成減少，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。因此，GCs引起的骨髓脂質(zhì)代謝紊亂在GIOP發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。長期使用GCs也可以促使骨髓外脂肪組織動員和分解，增高機(jī)體血清總膽固醇（TCHO）和甘油三酯（TG）水平，

3、導(dǎo)致高脂血癥，而高血脂癥可先于骨質(zhì)疏松出現(xiàn)。脂質(zhì)代謝和骨質(zhì)疏松有著密切關(guān)系。臨床上應(yīng)用降血脂藥物治療的同時(shí)可增加患者骨密度水平，降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)。如果能有效的抑制骨髓脂質(zhì)代謝紊亂和糾正機(jī)體血脂異常狀態(tài)，可以對GIOP的發(fā)病、骨質(zhì)疏松程度、骨折風(fēng)險(xiǎn)起到防治作用。
　　GIOP臨床藥物治療花費(fèi)高、副作用多，因此有必要探尋一種安全、副作用小、費(fèi)用低廉的治療方法。脈沖電磁場（PEMF）作為一種無創(chuàng)的物理因子治療手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種骨科疾

4、病。循證醫(yī)學(xué)已證實(shí)PEMF在治療骨質(zhì)疏松方面安全且有效，可以作為防治OP的輔助手段。臨床與實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PEMF在抗骨質(zhì)疏松的同時(shí)還可以改善機(jī)體的血脂異常。目前尚未有研究PEMF通過調(diào)節(jié)GIOP脂質(zhì)代謝途徑干預(yù)骨代謝的相關(guān)報(bào)道。介于脂質(zhì)代謝對GIOP發(fā)病的影響，探討PEMF對GIOP的療效是否得益于對其脂質(zhì)代謝的調(diào)控，對PEMF防治GIOP的機(jī)制研究有著重要意義。
　　目前采用GCs誘導(dǎo)GIOP動物模型的方法很多，但GCs選擇、給藥

5、途徑、用藥劑量等要素不統(tǒng)一，會對后續(xù)研究工作造成一定影響。本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，擬采用肌注地塞米松的方法建立GIOP大鼠模型，為規(guī)范建立GIOP動物模型提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)探討PEMF調(diào)控 GIOP大鼠脂質(zhì)代謝信號通路的機(jī)制及其對骨代謝的影響，對于初步闡明PEMF抗骨質(zhì)疏松的機(jī)制具有重要的科學(xué)意義和相關(guān)臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　第一部分 GIOP大鼠模型的建立
　　目的：
　　采用肌注超生理劑量的地塞米松構(gòu)建GIO

6、P大鼠模型，試圖建立可靠穩(wěn)定的造模方法，為探討PEMF治療GIOP的潛在機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)對象。
　　方法：
　　20只健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為對照組和GIOP模型組。GIOP模型組大鼠右側(cè)臀部肌注地塞米松（2.5 mg/kg，每周2次）連續(xù)12周。對照組大鼠右側(cè)臀部肌注生理鹽水（0.5 ml/kg，每周2次）連續(xù)12周。12周后進(jìn)行骨密度、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析、骨代謝生化指標(biāo)和脂質(zhì)代謝生化指標(biāo)檢測評價(jià)GIOP大鼠模型。
　

7、　結(jié)果：
　　與對照組大鼠相比，模型組大鼠全身骨密度和骨礦鹽含量明顯下降，骨小梁破壞嚴(yán)重、數(shù)量減少，血清ALP水平降低，血清TRAP、TG, TCHO和LDL水平均顯著升高。
　　結(jié)論：
　　肌肉注射地塞米松（2.5mg/kg,2次/周）12周可以成功建立GIOP大鼠模型，為本研究提供穩(wěn)定、可靠的動物模型。
　　第二部分PEMF對GIOP大鼠骨髓脂質(zhì)代謝的影響及機(jī)制
　　目的：
　　研究PEMF干預(yù)對

8、GIOP大鼠BMSCs成脂分化和脂質(zhì)代謝的影響，探討相關(guān)信號通路的調(diào)控，初步闡明PEMF干預(yù)GIOP大鼠脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。
　　方法：
　　(1)40只健康SD雌性大鼠隨機(jī)分為正常組、GIOP模型組、鈣劑治療組和PEMF治療組。GIOP模型組、鈣劑治療組和PEMF治療組采用肌肉注射地塞米松（2.5mg/kg,2次/周）12周復(fù)制GIOP大鼠模型。12周后進(jìn)行骨密度、骨代謝生化指標(biāo)和脂質(zhì)代謝生化指標(biāo)檢測評價(jià)GIOP大鼠模型。

9、
　　(2)PEMF治療組大鼠給予PEMF（50 Hz，4.0 mT）干預(yù)12周。鈣劑治療組大鼠給予葡萄糖酸鈣片灌胃治療及PEMF假輻射12周。正常組和GIOP模型組大鼠均給予PEMF假輻射和生理鹽水灌胃處理12周。
　　(3)采用血清脂質(zhì)代謝生化指標(biāo)檢測評價(jià)各組大鼠血脂狀況；
　　(4)采用油紅O染色和L4椎體骨組織病理學(xué)觀察評價(jià)各組大鼠骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞分化程度；
　　(5)Real-time PCR檢測脂質(zhì)代

10、謝相關(guān)指標(biāo)PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Axin2基因表達(dá)水平；
　?。?）Western bolt檢測檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Axin2蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）與正常組大鼠相比，GIOP模型組、鈣劑治療組和PEMF治療組大鼠給予肌注地塞米松12周后全身骨密度和骨礦鹽含量明顯下降，血清ALP水平降低，血清TRAP、TG, TCHO和LDL水平均顯著升高。GIO

11、P大鼠模型復(fù)制成功。
　?。?）血清脂質(zhì)代謝生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明PEMF干預(yù)12周后可以顯著改善GIOP大鼠血脂異常；
　?。?）油紅O染色和L4椎體骨組織病理學(xué)觀察表明PEMF干預(yù)12周后GIOP大鼠骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞減少；
　?。?）Real-time PCR檢測結(jié)果表明：PEMF干預(yù)12周后GIOP大鼠PPAR-γ、 C/EBPα、FABP4和Axin2基因表達(dá)水平顯著下調(diào)；
　?。?）Western bolt

12、檢測結(jié)果表明：PEMF干預(yù)12周后GIOP大鼠PPAR-γ、 C/EBPα、FABP4和Axin2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　PEMF干預(yù)能夠抑制GIOP大鼠BMSCs成脂分化，減少骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞，改善骨髓脂質(zhì)代謝紊亂。PEMF干預(yù)可能通過下調(diào)Axin2/PPARγ信號通路來抑制GIOP大鼠BMSCs脂肪分化。
　　第三部分 PEMF對GIOP大鼠骨代謝的影響及機(jī)制
　　目的：
　　本部分研究以

13、第二部分研究的GIOP大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，觀察PEMF干預(yù)對GIOP大鼠BMSCs成骨分化和骨代謝的影響，進(jìn)一步探討相關(guān)信號通路的調(diào)控，初步闡明PEMF干預(yù)GIOP大鼠骨代謝的作用機(jī)制。
　　方法：
　?。?）采用骨密度及骨礦鹽含量檢測評價(jià)各組大鼠骨量狀況；
　?。?）采用血清骨代謝生化指標(biāo)檢測評價(jià)各組大鼠骨代謝狀況；
　?。?）采用骨組織病理學(xué)和骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析評價(jià)腰椎體內(nèi)骨小梁狀況；
　?。?）采用R

14、eal-time PCR檢測Wnt10b、LRP5、β-catenin、OPG、RANKL、Runx2、Dkk1和SOST基因表達(dá)水平；
　?。?）采用Western bolt檢測Wnt10b、LRP5、β-catenin、OPG、RANKL、Runx2、Dkk1和SOST蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）骨密度檢測結(jié)果表明PEMF干預(yù)12周可以顯著改善GIOP大鼠骨質(zhì)疏松程度；
　?。?）血清骨代謝生化指標(biāo)

15、檢測結(jié)果表明PEMF干預(yù)12周后可以顯著改善GIOP大鼠骨代謝異常；
　?。?）骨組織病理學(xué)和骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果表明PEMF干預(yù)12周后可以改善GIOP大鼠腰椎體內(nèi)骨小梁狀況；
　?。?）Real-time PCR檢測結(jié)果表明PEMF干預(yù)12周后可以顯著上調(diào)GIOP大鼠Wnt10b、 LRP5、β-catenin和OPG基因表達(dá)水平，顯著下調(diào)RANKL和Dkk1基因表達(dá)水平；
　?。?）Western bolt檢

16、測結(jié)果表明PEMF干預(yù)12周后可以顯著上調(diào)GIOP大鼠Wnt10b、LRP5和Runx2蛋白表達(dá)水平，顯著下調(diào)RANKL和Dkk1蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　PEMF干預(yù)能夠促進(jìn)GIOP大鼠BMSCs成骨分化，改善骨代謝異常，抑制骨量流失，促進(jìn)骨形成。本部分研究表明PEMF干預(yù)激活Wnt10b/LRP5/β-catenin信號通路可能是由于Axin2/PPARγ信號通路被抑制以及Dkk1表達(dá)下調(diào)來實(shí)現(xiàn)。PPARγ-Axi