Dishevelled-2通過(guò)交叉調(diào)控Wnt和NF-κB信號(hào)通路對(duì)骨代謝的作用機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是最常見的自身免疫性疾病之一，以持續(xù)性關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜炎癥引起的骨及軟骨損害為特征。在我國(guó)致殘性疾病中，位列第二位，且其發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)。目前針對(duì)阻斷關(guān)節(jié)炎癥的治療方法較多，但對(duì)于關(guān)節(jié)破壞的分子機(jī)制的研究尚不夠明確，有效阻斷關(guān)節(jié)破壞的的藥物不多。研究表明，Wnt和NF-κB信號(hào)通路可分別作用于成骨和破骨細(xì)胞從而共同維持骨代謝動(dòng)態(tài)平衡，干擾Wnt通路激活聯(lián)合增強(qiáng)NF-κB通路激活能夠抑制成骨細(xì)胞的增殖分化和促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖分化

2、，破壞骨代謝平衡，均參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。Dishevelled(Dvl)一方面在Wnt通路發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，另一方面亦參與NF-κB調(diào)控，我們研究發(fā)現(xiàn)Dvl在RA小鼠模型中關(guān)節(jié)局部呈高表達(dá)狀態(tài)。因而，Dvl可能通過(guò)兩條通路的共同作用，維持骨代謝平衡，對(duì)于Dvl對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞作用機(jī)制的研究，將為RA的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。
　　目的:
　　本研究選取C2C12細(xì)胞系和RAW264.7細(xì)胞系作為研究對(duì)象，

3、通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶Dvl-2的基因表達(dá)質(zhì)粒和Dvl-2-siRNA干擾序列，檢測(cè)Wnt和NF-κB信號(hào)通路活性及OPG、RANKL、胞內(nèi)β-catenin及IκB-α表達(dá)量的變化，初步探討Dvl-2通過(guò)交叉調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin和NF-κB信號(hào)通路，對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞增殖分化的影響。
　　方法:
　　首先，采用Lipofectamine2000法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Dvl-2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及Dvl-2-siRNA干擾片段，上調(diào)或下調(diào)

4、細(xì)胞內(nèi)Dvl-2的表達(dá)量，通過(guò)熒光顯微鏡觀察和Real-time PCR及Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。然后，通過(guò)CCK8法檢測(cè)Dvl-2對(duì)C2C12細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞增殖能力的影響。C2C12細(xì)胞予以相應(yīng)處理后收集上清液，通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)C2C12細(xì)胞中骨保護(hù)素的分泌情況。Western blot法檢測(cè)C2C12細(xì)胞內(nèi)RANKL蛋白的表達(dá)量和通路下游細(xì)胞內(nèi)β-catenin的含量。通過(guò)將TCF報(bào)告基因質(zhì)?；颚?/p>

5、B-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒和PRL-SV40報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，利用GloMax20/20發(fā)光檢測(cè)儀分別檢測(cè)Wnt及NF-κB信號(hào)通路的激活狀態(tài)。Western blot法檢測(cè)NF-κB相關(guān)靶基因IκB-α的表達(dá)量。采用蛋白免疫共沉淀測(cè)定Dvl-2能否與p65的結(jié)合。最后，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Dvl-2過(guò)表達(dá)質(zhì)?；駾vl-2-siRNA干擾片段，轉(zhuǎn)染36h后，熒光顯微

6、鏡下觀察到細(xì)胞免疫熒光的表達(dá);采用PCR和Western blot方法檢測(cè)結(jié)果一致，與對(duì)照組相比，Dvl-2過(guò)表達(dá)組Dvl-2表達(dá)量升高，Dvl-2-siRNA組Dvl-2表達(dá)量降低。
　　2.CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白質(zhì)粒組相比，Dvl-2過(guò)表達(dá)組C2C12細(xì)胞增殖能力并無(wú)顯著變化;RAW264.7細(xì)胞增殖能力降低。
　　3.C2C12細(xì)胞分別給予相應(yīng)處理48h后，采用ELISA法測(cè)定上清液OPG濃度，結(jié)果顯示Dvl-2

7、、Wnt3a單獨(dú)刺激均可上調(diào)OPG的濃度，與對(duì)照組相比有顯著性差異，且Dvl-2上調(diào)OPG分泌的能力高于Wnt3a;轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)Dvl-2表達(dá)后，OPG濃度較對(duì)照組降低。
　　4.同樣，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Dvl-2過(guò)表達(dá)組C2C12細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)量較對(duì)照組降低，轉(zhuǎn)染siRNA抑制Dvl-2表達(dá)后，RANKL蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高。
　　5.TCF報(bào)告基因質(zhì)粒和Dvl-2基因

8、表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示單獨(dú)Dvl-2、Wnt3a均可激活TCF報(bào)告基因質(zhì)粒，兩者共刺激組TCF報(bào)告基因質(zhì)粒激活程度更高。Dvl-2-siRNA組TCF報(bào)告基因質(zhì)?；钚暂^對(duì)照組降低。
　　6.Western blot檢測(cè)顯示相對(duì)于空白質(zhì)粒組，Dvl-2過(guò)表達(dá)組β-catenin含量也有所升高;下調(diào)Dvl-2表達(dá)后，β-catenin蛋白含量降低。
　　7.在RAW264.7細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

9、顯示，與空白質(zhì)粒組相比，Dvl-2過(guò)表達(dá)組κB-Luc報(bào)告基因活性降低，兩者有顯著性差異，下調(diào)Dvl-2表達(dá)后，κB-Luc報(bào)告基因活性升高;同時(shí)Dvl-2可下調(diào)NF-κB相關(guān)靶基因IκB-α的表達(dá)。
　　8.為明確Dvl-2抑制NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制，采用Dvl-2與p65蛋白免疫共沉淀結(jié)果顯示Dvl-2可與p65特異性結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　1.Dvl-2對(duì)C2C12細(xì)胞增殖無(wú)影響;Dvl-2過(guò)表達(dá)可抑制RAW2

10、64.7細(xì)胞增殖;
　　2.Dvl-2通過(guò)經(jīng)典Wnt/β-catenin通路促進(jìn)C2C12細(xì)胞OPG的分泌，Dvl-2上調(diào)OPG分泌的能力高于Wnt3a，一方面可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化;另一方面Dvl-2可下調(diào)C2C12細(xì)胞RANKL的表達(dá)量，影響OPG/RANKL比值，通過(guò)NF-κB主導(dǎo)的RANK-RANKL-OPG信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞的成熟分化;
　　3.Dvl-2可激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)胞內(nèi)β-ca