CYLD介導NF-κB信號通路對胰腺癌的作用研究.pdf

1、目的：胰腺癌（PC）是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的2.4％，在美國，胰腺癌導致的腫瘤相關(guān)死亡率排第四位，在我國排第6位。近年來，胰腺癌發(fā)病率有逐年上升的趨勢，且由于胰腺癌發(fā)病隱匿，發(fā)展速度快，手術(shù)切除率低，約20%-25%，術(shù)后5年生存率僅15%-20%，而失去手術(shù)機會的晚期胰腺癌患者5年生存率低于1%。因此應(yīng)加強對胰腺癌基因和分子水平的研究,進一步探索胰腺癌的發(fā)病機制,提高胰腺癌的診治水平，改善預(yù)后。

2、　　研究表明，胰腺癌的生物學行為是一個多環(huán)節(jié)、多種調(diào)節(jié)機制、多因素相互作用所導致的結(jié)果，其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的作用。胰腺癌發(fā)生發(fā)展和多個抑癌基因的失活有著密切的關(guān)系，抑癌基因的表達沉默是胰腺癌一種主要的分子生物學改變。CYLD是一種細胞內(nèi)多功能去泛素化酶，作用于NF-κB、TGF-β及JNK等多條信號通路，從而調(diào)控細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及血管生成等多種生物學過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中

3、，發(fā)揮著抑癌基因的作用。CYLD在胰腺癌中的作用尚未見明確報道，本實驗中，觀察了CYLD在胰腺癌中的表達情況及其與臨床參數(shù)之間的關(guān)系，并對其在胰腺癌細胞中的作用及機制進行了初步的研究。
　　方法：分別采用qRT-PCR和Western blotting方法檢測胰腺癌新鮮癌組織和癌旁正常組織中 CYLD mRNA和蛋白的表達水平，進一步應(yīng)用免疫組織化學染色方法檢測了胰腺癌組織石蠟包埋切片中CYLD的表達水平。統(tǒng)計分析了 CYLD表達

4、水平與胰腺癌臨床參數(shù)之間的關(guān)系。細胞實驗中采用 Western blotting方法篩選 CYLD介于高表達和低表達之間的胰腺癌細胞系 PANC-1，而后分別以 CYLD-shRNA及pcDNA3.0(-)/CYLD轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細胞，CCK-8、流式細胞儀、細胞劃痕實驗、transwell侵襲實驗等實驗方法檢測細胞增值、凋亡、侵襲及遷移能力，評估了PANC-1細胞中CYLD對NF-κB信號通路及其下游信號分子CyclinD1及

5、MMP9的影響。最后，采用裸鼠皮下成瘤實驗觀察過表達CYLD對成瘤的影響。
　　結(jié)果：
　　1、相比正常的胰腺組織，胰腺癌組織中CYLD蛋白及mRNA表達水平均有不同程度的降低。免疫組化顯示正常胰腺組織中，CYLD在胞漿及胞核中均有表達，而癌組織胞漿表達降低，胞核幾乎不表達。CYLD表達水平與胰腺癌患者的N分級(P=0.003)，AJCC分期(P=0.029)和組織分化程度顯著相關(guān)。Spearman相關(guān)性分析顯示CYLD的表

6、達和胰腺癌患者的組織學分化程度(0.403，P=0.007)、AJCC分期(0.330，P=0.029)和 N分級(0.447，P=0.002)顯著相關(guān)。我們還采用Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗分析了CYLD對患者總體生存的影響，結(jié)果顯示CYLD表達水平與胰腺癌患者生存時間顯著相關(guān)(P=0.002)。CYLD CYLD高表達組平均生存時間為16.72個月（95% CI，14.12—19.31個月）,2年累積生存率為1

7、7%；而低表達的患者平均生存時間為8.27個月（95% CI，5.61—10.88個月），2年累積生存率為5.4%。多因素COX回歸分析顯示，CYLD表達水平（P＝0.014）、M分級（P＝0.041）和AJCC分期（P＝0.034）為胰腺癌的獨立預(yù)后因子。
　　2、采用Western blotting及qRT-PCR法檢測了胰腺導管上皮細胞HDPE6-C7及人胰腺癌細胞AsPC-1、PANC-1、HPAC系中 CYLD蛋白及mR

8、NA的表達水平，結(jié)果顯示4個細胞系中CYLD表達水平高低順序依次為 AsPC-1

9、YLD可有效增加PANC-1細胞中CYLD表達，并產(chǎn)生與上述相反之效應(yīng)。最后在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CYLD shRNA的PANC-1細胞中加入NF-κB抑制劑PTDC，發(fā)現(xiàn)PTDC能夠減弱CYLD shRNA所致的NF-κB活化，而過表達CYLD的PANC-1細胞中加入NF-κB激活劑TNF-α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達CYLD能夠有效抑制TNF-α對NF-κB信號通路的激活作用。
　　3、體內(nèi)實驗顯示pcDNA3.0(-)/CYLD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PANC

10、-1細胞成瘤顯著小于對照組，且瘤組織 CYLD mRNA及蛋白表達顯著高于對照組。結(jié)果顯示過表達CYLD抑制了裸鼠皮下移植瘤的生長。
　　結(jié)論：綜上所述，CYLD是一個新的具有一定診斷意義的生物學標志物，并且對胰腺癌患者的預(yù)后判斷有預(yù)測意義；CYLD通過抑制 NF-κB信號通路抑制了胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，對胰腺癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用。過表達 CYLD可以有效改善胰腺癌細胞的惡性生物學行為并且抑制腫瘤的生長，提示