阻斷Hedgehog信號(hào)通路對(duì)胰腺癌干細(xì)胞自我更新的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、胰腺癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈不斷上升的越勢(shì)，占消化道惡性腫瘤的8％～10％。由于缺乏早期的臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者在確診時(shí)已屬晚期，只有約12％～15％可進(jìn)行根治手術(shù)，但術(shù)后容易復(fù)發(fā)，預(yù)后甚差。傳統(tǒng)的化療藥物僅針對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行治療，實(shí)驗(yàn)證明，胰腺癌中存在一群數(shù)量極少的腫瘤干細(xì)胞，其具有自我更新、多向分化及無(wú)限增殖的特性；腫瘤干細(xì)胞自我更新的概念是腫瘤干細(xì)胞指在增殖過(guò)程中，通過(guò)不均一分裂，一個(gè)CSC(cancer stem cell)可分

2、裂成一個(gè)新的CSC和另一個(gè)可最終分化為包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞的子細(xì)胞，使腫瘤能夠維持CSC數(shù)目穩(wěn)定并能不斷產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞；胰癌干細(xì)胞通過(guò)自我更新，不斷產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞，令腫瘤的治療不能將癌細(xì)胞徹底殺滅，是導(dǎo)致腫瘤治療效果差、易復(fù)發(fā)及預(yù)后差的主要原因。 Hedgehog(HH)信號(hào)通路是腫瘤干細(xì)胞的自我更新機(jī)制之一，主要由四部分所組成，包括：HH配體、2個(gè)跨膜蛋白質(zhì)受體(PTCH)、(Smo)組成的受體復(fù)合物以及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gl

3、i蛋白，通過(guò)激活此通路使腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力增強(qiáng)；cyclopamine(環(huán)巴明)是Hedgehog信號(hào)通路的抑制劑，通過(guò)作用于Smo蛋白阻止該信號(hào)往下傳遞，從而抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新。目前國(guó)內(nèi)外的研究已證實(shí)Hedgehog通路在多種腫瘤中有表達(dá)，Hedgehog通路的研究可以為日后針對(duì)腫瘤干細(xì)胞治療提供更進(jìn)一步的資料。 腫瘤干細(xì)胞自我更新的機(jī)制目前認(rèn)為有以下五點(diǎn)：①Hedgehog信號(hào)通路；②Wnt信號(hào)途徑；③polyc

4、omb group基因家族；④CSC的微環(huán)境；⑤成纖維生長(zhǎng)因子信號(hào)。不同種類的或者類型相同的腫瘤在不同的發(fā)展階段中，腫瘤干細(xì)胞存在自我更新的信號(hào)表達(dá)可能有差異，而且，各機(jī)制之間也可能存在相互影響。 為了進(jìn)一步了解胰腺癌干細(xì)胞自我更新的特性，在國(guó)內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上，我們推測(cè)胰腺癌干細(xì)胞可能存在Hedgehog信號(hào)通路，且參與其自我更新的作用，通過(guò)cyclopamine阻斷該通路，從細(xì)胞增殖、周期及凋亡等方面分析其作用機(jī)制，為今后針對(duì)

5、胰腺癌干細(xì)胞治療的研究作初步探討。 研究目的： 選擇cyclopamine特異性阻斷Hedgehog信號(hào)通路，觀察其對(duì)胰腺癌干細(xì)胞自我更新能力的影響作用及其機(jī)制，探討阻斷Hedgehog信號(hào)通路對(duì)胰腺癌的可能治療作用。 材料和方法： 實(shí)驗(yàn)材料： 細(xì)胞系胰腺癌PANC-1細(xì)胞由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供；永生化胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞H6C7細(xì)胞由加拿大安大略癌癥研究所惠贈(zèng)。胰腺癌PANC-1細(xì)

6、胞培養(yǎng)在RPMI1640(含10％胎牛血清)。H6C7細(xì)胞培養(yǎng)在K—SFM培養(yǎng)基中。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.胰腺癌干細(xì)胞的獲得方法：將PANC-1球囊細(xì)胞培養(yǎng)方法到第12-15天；PANC-1細(xì)胞及H6C7細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)； 2.cyclopamine對(duì)胰腺癌干細(xì)胞自我更新能力的影響作用：WST—8法檢測(cè)cyclopamine在不同濃度(0，0.5，1，2，5，10umol/L)及不同時(shí)間(24，48，7

7、2h)對(duì)細(xì)胞自我更新的抑制情況； 3.細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)采用流式細(xì)胞技術(shù)，根據(jù)WST—8法檢測(cè)結(jié)果選取cyclopamine10 umol/L濃度及72h分別處理上述三種細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)加藥前后細(xì)胞周期及凋亡的變化。 統(tǒng)計(jì)方法： 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。應(yīng)用SPSS11.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。顯著性差異水平為P<0.05。

8、 結(jié)果： 1.采用懸浮法培養(yǎng)獲得胰腺癌干細(xì)胞，傳代。 2.胰腺癌PANC-1球囊細(xì)胞經(jīng)5、10umol/L濃度的cyclopamine處理72h后細(xì)胞隨著濃度的提高抑制率呈逐漸上升的趨勢(shì)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后5及10umol/L的濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其抑制率分別為(31.66±5.30)％、(37.85±13.69)％。而24h及48h未見明顯抑制。 3.cyclopamine對(duì)胰胰腺癌PANC-1細(xì)胞無(wú)明顯抑

9、制作用，而對(duì)永生化胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞H6C7于10umol/L的濃度處理72h后對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，其抑制率為(43.55±28.98)％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而24h及48h未見明顯抑制。 4.選取10umol/L濃度的cyclopamine分處理實(shí)驗(yàn)細(xì)胞72h后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)；胰腺癌PANC-1球囊細(xì)胞及胰腺癌PANC-1細(xì)胞出現(xiàn)G1期下降，分別占(36.53±6.03)％及(53.13±1.10)％，而對(duì)照組G1期分別占

10、(67.41±6.35)％及(67.64±6.88)％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。永生化胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞H6C7則未見明顯變化(P>0.05)。 5.選取10umol/L濃度的cyclopamine分處理實(shí)驗(yàn)細(xì)胞72h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)；結(jié)果顯示，三種實(shí)驗(yàn)細(xì)胞于加藥前后凋亡細(xì)胞數(shù)均未見明顯變化(P>0.05)。 結(jié)論： 1.胰腺癌PANC-1球囊細(xì)胞可能存在Hedgehog信號(hào)通路，且與其自我更新密切相關(guān)； 2.永