ARHI基因轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細(xì)胞單克隆穩(wěn)定株的建立及對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移信號(hào)通路的影響初探.pdf

1、胰腺癌是惡性度很高的腫瘤,近年來(lái)胰腺癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì),目前已經(jīng)成為美國(guó)第四位的腫瘤死因。因?yàn)槿鄙儆行У刂委熓侄?胰腺癌患者生存期短,生活質(zhì)量差,5年總生存率<5％,中位生存期僅有6個(gè)月。
　　 胰腺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為是由一系列基因突變引起的。已發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路參與其發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。因?yàn)橐认侔┮自缙诎l(fā)生轉(zhuǎn)移,常轉(zhuǎn)移至肝、腹腔等部位,因此晚期胰腺癌患者的轉(zhuǎn)移成為目前胰腺癌晚期治療的一個(gè)重點(diǎn)。目前已知多個(gè)信號(hào)分子參與

2、腫瘤的轉(zhuǎn)移,包括趨化因子(chemokine)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)通路等,而對(duì)這些信號(hào)通路的深入研究有助于了解胰腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制并為后續(xù)靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　 ARHI基因是1999年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)母源性印跡基因,是Ras超家族成員之一,其編碼的蛋白在人類(lèi)多種組織中表達(dá),但在乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌中卻存在表達(dá)下調(diào),多個(gè)研究提示ARHI是一個(gè)抑癌基因。
　　 我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明ARHI基因在胰腺癌組織中也發(fā)

3、揮抑癌基因的作用。ARHI基因在正常胰腺組織廣泛表達(dá),但在胰腺癌組織(47.8％)和細(xì)胞(8/8)中表達(dá)下調(diào)或缺失。通過(guò)瞬時(shí)和多克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將ARHI基因?qū)氡磉_(dá)缺失的胰腺癌細(xì)胞中,研究發(fā)現(xiàn)ARHI可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。
　　 目前尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道已建立ARHI的單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株。本課題在前期已經(jīng)建立ARHI多克隆胰腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株的基礎(chǔ)上嘗試建立單克隆的胰腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株,為后續(xù)深入研究ARHI功能打下基礎(chǔ),并同

4、時(shí)初步探討ARHI穩(wěn)定表達(dá)是否會(huì)影響胰腺癌轉(zhuǎn)移信號(hào)通路。
　　 第一部分 ARHI基因轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細(xì)胞單克隆穩(wěn)定株的建立方法:應(yīng)用我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的攜帶ARHI基因編碼序列的。pIRES2-ARHI-EGFP質(zhì)粒以及新構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒pLNCX2-ARHI-EGFP,采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細(xì)胞系,用G418篩選4周后挑選發(fā)綠色熒光的單克隆細(xì)胞,擴(kuò)大培養(yǎng)后用RT-PCR及western blot驗(yàn)證ARHI

5、基因轉(zhuǎn)錄及翻譯情況。單克隆穩(wěn)定株建立后分別用MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究ARHI對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。
　　 研究結(jié)果:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后ARHI組可見(jiàn)ARHI基因mRNA表達(dá),而空載體組及正常PANC-1細(xì)胞組無(wú)ARHI mRNA表達(dá)；ARHI組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)均可見(jiàn)ARHI蛋白表達(dá),且24小時(shí)表達(dá)量最大,正常PANC-1細(xì)胞組和空載體組無(wú)ARHI蛋白表達(dá)；G418篩選4周后可見(jiàn)綠色團(tuán)簇狀細(xì)胞,經(jīng)單

6、克隆篩選后可篩選出全部發(fā)綠色熒光的PANC-1細(xì)胞；RT-PCR和western blot檢測(cè)單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株均能表達(dá)ARHI,而多克隆空載體組及正常PANC-1組無(wú)ARHI的表達(dá)；單克隆穩(wěn)定株中,ARHI可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖,在4-5天時(shí)與空載體組相比有明顯的差異性(P<0.05)；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示第12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí),ARHI組細(xì)胞遷移速率比空載體組減慢,具有顯著性差異(P<0.01),和PANC-1對(duì)照組相比遷移速率也

7、減慢,同樣具有顯著性差異(P<0.01)。
　　 小結(jié):1)使用普通質(zhì)粒(pIRES2-EGFP)和慢病毒質(zhì)粒(pLNCX2)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)ARHI的單克隆PANC-1細(xì)胞株；2)單克隆穩(wěn)定株中穩(wěn)定表達(dá)的ARHI可抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖和遷移。
　　 第二部分體外實(shí)驗(yàn)初探抑癌基因ARHI對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移信號(hào)通路的影響方法:應(yīng)用已經(jīng)建立的ARHI單克隆穩(wěn)定株,通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)ARHI對(duì)趨化因子(

8、CXCL1、CXCL8)以及VEGF通路(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和HIFα)mRNA表達(dá)量的影響；通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察ARHI對(duì)細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)量的影響。
　　 研究結(jié)果:和空載體組相比,單克隆穩(wěn)定表達(dá)ARHI組的CXCL1、CXCL8的mRNA表達(dá)量顯著低于前者,具有顯著性差異(P<0.05)；單克隆穩(wěn)定表達(dá)ARHI組的VEGF-A、VEGF-B和HIFα的mRNA表達(dá)量高于空載體組,具有顯著性差異(P

9、<0.05),而VEGF-C的mRNA水平在兩者間沒(méi)有差異(P>0.05)；用VEGF單克隆抗體對(duì)ARHI單克隆穩(wěn)定株進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)量和空載體組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05).
　　 小結(jié):1)單克隆穩(wěn)定株中ARHI可抑制趨化因子CXCL1和CXCL8 mRNA的表達(dá)；2)單克隆穩(wěn)定株中ARHI可能促進(jìn)VEGF-A、VEGF-B和HIFα mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)論: