抗壞血酸誘導(dǎo)胰腺癌Panc-1細(xì)胞的死亡方式及其機制.pdf

1、胰腺癌(Pancreaticcareinoma)近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢。由于其早期診斷率低，惡性程度高，臨床治療棘手，五年生存率低，如何提高療效一直為人們所關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖和死亡平衡失調(diào)有關(guān)。因而，目前臨床上治療腫瘤所應(yīng)用的許多手段如化療、放療、激素治療、熱療以及生物療法等，其作用機制之一是誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，如何實現(xiàn)人為地調(diào)控程序性細(xì)胞死亡的速率是當(dāng)前腫瘤研究的一個焦

2、點?？箟难?ascorbicacid，Asc)，又稱維生素C，是具有許多生物學(xué)功能的水溶性葡萄糖類物質(zhì)，因其安全、便宜，應(yīng)用方便，且無明顯毒副作用，故其抗腫瘤作用的研究正在不斷成為一個熱門話題。體外培養(yǎng)細(xì)胞、動物實驗等多項研究[1、2、3、4]已經(jīng)證實抗壞血酸主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的，其作用機制可能是降低細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶的濃度，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成增加，其中主要以生成H2O2為主，從而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)

3、生殺傷作用[3,5,6,7]，但同時又對正常細(xì)胞無明顯影響。鑒于目前尚無體外實驗研究抗壞血酸對胰腺癌細(xì)胞的作用，故本文以胰腺癌Panc—1細(xì)胞株為試驗對象設(shè)計此課題，觀察抗壞血酸干預(yù)對其產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，為ASC參與抑制胰腺癌細(xì)胞增殖提供依據(jù)，并初步探究其作用機制，為治療胰腺癌的新策略提供思路。 實驗?zāi)康模?觀察Asc對胰腺癌細(xì)胞死亡及增殖的影響；觀察抗氧化劑及紅細(xì)胞對Asc介導(dǎo)的Panc—1細(xì)胞死亡的抑制作用，從而驗證

4、抗壞血酸是通過介導(dǎo)ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)Panc—1細(xì)胞發(fā)生脹亡從而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的理論假設(shè)。 實驗方法： 采用MTT法觀察Asc對胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖抑制作用，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞增殖周期變化及凋亡率，光鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。為探討Asc介導(dǎo)的Panc—1細(xì)胞死亡機制，用細(xì)胞外抗氧化劑過氧化氫酶(Catalase)以及紅細(xì)胞預(yù)處理Panc-1細(xì)胞后再加入不同濃度Asc，進行電鏡形態(tài)學(xué)觀察；并利用JC-1染色

5、流式細(xì)胞儀檢測Asc對Panc-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響。 實驗結(jié)果： 1、Asc在體外對胰腺癌Panc-1細(xì)胞有增殖抑制作用，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期培養(yǎng)人胰腺癌Panc—1細(xì)胞利用不同濃度ASC干預(yù)24h、48h、72h，MTT結(jié)果表明隨著Asc濃度的增加、作用時間的延長，Panc-1細(xì)胞存活率明顯降低，Asc作用48小時，對Panc-1細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)為2.070mmol/L，而在同等條件下對人

6、正常肝細(xì)胞HL-7702則無明顯抑制作用。PI染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示Asc將Panc—1細(xì)胞阻滯在G2/M期，但未觀察到凋亡峰出現(xiàn)。 2、Asc誘導(dǎo)胰腺癌Panc-1細(xì)胞發(fā)生脹亡性死亡倒置顯微鏡及HE染色后光鏡下觀察到5mmol/L及以上濃度Asc可致Panc-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹性壞死，但未見細(xì)胞凋亡。透射電鏡顯示，經(jīng)Asc作用后Panc-1細(xì)胞胞漿中有大量空泡形成，線粒體腫脹，嵴破壞，呈絮狀改變；胞核腫脹，核內(nèi)染色質(zhì)分散，

7、符合最近提出的一種新型細(xì)胞死亡方式—脹亡性死亡的特征性改變[8-10]。 3、胰腺癌Panc-1細(xì)胞發(fā)生脹亡性死亡可能與Asc介導(dǎo)的H2O2產(chǎn)生及細(xì)胞線粒體損傷有關(guān)，且紅細(xì)胞能抑制這一作用的發(fā)生流式細(xì)胞儀分析顯示，經(jīng)5、20mmol/LAsc作用24小時，與陰性對照組比較，Panc—1細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低，且有濃度依賴性。細(xì)胞外抗氧化劑Catalase及紅細(xì)胞預(yù)處理細(xì)胞能明顯抑制細(xì)胞線粒體膜電位的下降，減輕細(xì)胞發(fā)生脹亡的程度