鹽酸普魯卡因?qū)σ认侔㏄ANC-1細胞增殖的影響及其作用機制.pdf

1、　　目的：至今胰腺癌確切病因不明,可能與吸煙、飲酒、咖啡、高蛋白飲食、環(huán)境、職業(yè)、家族和遺傳因素等相關(guān)。伴隨著分子生物學的發(fā)展,縱觀國內(nèi)外研究關(guān)于胰腺癌發(fā)病機制的探討很多,多數(shù)從分子基因水平進行,其發(fā)生發(fā)展與其他腫瘤一樣可能涉及癌基因激活、抑癌基因失活和基因錯配修復。表觀遺傳學成為近年研究的熱點,特別是抑癌基因啟動子的高甲基化與去乙?；挂职┗虮磉_沉默失去抑癌作用,成為胰腺惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的一種機制,揭示了部分胰腺癌發(fā)生發(fā)展的原因,

2、異常表觀遺傳學改變征像為早期血清學或是外分泌液檢測和早期診斷治療提供理論依據(jù),同時擬尋找新的早期胰腺癌特異腫瘤標志物。本實驗將探討鹽酸普魯卡因(procaine, PCA)對人胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響,分析藥物處理前后腫瘤壞死因子受體超家族成員10C (TNFRSF10C) mRNA表達的變化,并探討鹽酸普魯卡因抑制人胰腺癌PANC-1細胞增殖的分子機制,以期為胰腺癌的發(fā)病機制及治療提供新的思路并找到新的理論依據(jù)。
　　

3、方法：(1)體外培養(yǎng)人胰腺癌PANC-1細胞,四甲基偶氮唑鹽比色法觀察24小時、48小時、72小時及96小時細胞生長及抑制情況；分別以5 mmol/L PCA處理24 h,10 mmol/L PCA處理24 h,10 mmol/L PCA處理48 h,觀察細胞形態(tài)學改變；流式細胞儀檢測細胞生長周期改變；構(gòu)建體外甲基化DNA(IVD)和非甲基化(NL)的陽性對照,采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation- specific P

4、CR,MSP)檢測人胰腺癌PANC-1細胞中TNFRSF10C基因甲基化狀況；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)( RT-PCR)和蛋白印跡技術(shù)(Western Blotting)檢測人胰腺癌PANC-1細胞內(nèi)TNFRSF10C基因mRNA及蛋白表達情況。(2)用PCA和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)單獨及聯(lián)合處理PANC-1細胞,觀察細胞的增殖變化,檢測TNFR

5、SF10C mRNA在用藥前后表達有否改變,用甲基化特異性PCR法(Msp法)檢測胰腺癌PANC-1細胞TNFRSF10C基因啟動子甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果：(1)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被PCA處理后的人胰腺癌PANC-1細胞呈現(xiàn)體積縮小、融為空泡、并且漂浮于培養(yǎng)基中等增殖抑制及死亡的形態(tài)學特征；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)結(jié)果分析表明PCA能顯著抑制PANC-1細胞分裂增殖,其抑制率隨著藥物濃度的升高而增強；隨著時間的延長抑制率亦

6、增強；FCM結(jié)果證實PCA可以使PANC-1細胞的G2/M期細胞所占比例明顯升高,而s期細胞所占比例顯著性下降,PCA可使PANC-1細胞生長阻滯在G2/M期。(2)甲基化特異性PCR顯示PANC-1細胞TNFRSF10C基因啟動子CpG島存在甲基化狀態(tài)的異常表觀學現(xiàn)象,逆轉(zhuǎn)錄PCR顯示在人胰腺癌PANC-1細胞中TNFRSF10C基因低表達,表明人胰腺癌PANC-1細胞中TNFRSF10C基因啟動子CpG島甲基化可能是導致其表達沉默的

7、一種機制。(3)甲基化特異化PCR證實PCA能夠使人胰腺癌PANC-1細胞TNFRSF10C基因甲基化水平下降；反轉(zhuǎn)錄PCR和蛋白印跡技術(shù)結(jié)果顯示TNFRSF10C基因使用PCA處理后在胰腺癌PANC-1細胞中表達升高。
　　結(jié)論：PCA可使人胰腺癌PANC-1細胞的生長抑制在DNA合成前期(G0/G1),可以明顯抑制PANC-1細胞的分裂和增殖。TNFRSF10C基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化導致該基因表達沉默或失表達是胰腺癌發(fā)