鹽霉素通過(guò)Notch-Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)乳腺癌干細(xì)胞作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:乳腺癌在現(xiàn)如今世界上是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，是引發(fā)女性死亡的主要原因。目前雖然在治療水平有了很大的提高，但仍不能使大多數(shù)患者受益?！澳[瘤起源于腫瘤干細(xì)胞”這一學(xué)說(shuō)的提出及對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的深入研究為乳腺癌的治療提供了新的方向。腫瘤干細(xì)胞作為腫瘤組織的起始細(xì)胞，不僅具有自我更新和無(wú)限增殖的特征，還擁有重建腫瘤組織和放化療抵抗的能力，也是腫瘤放化療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因所在。近些年來(lái)和乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深入研究也為乳腺癌的臨

2、床治療提供了新的依據(jù)。
　　鹽霉素的分子結(jié)構(gòu)是特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，屬于一元羧酸聚醚類(lèi)，是一種新型的離子載體型抗生素，起初在白色鏈霉菌中被發(fā)現(xiàn)。它能通過(guò)中和抵消細(xì)胞內(nèi)的大多數(shù)陽(yáng)離子，對(duì)大部分的球蟲(chóng)和各種革蘭氏陽(yáng)性菌均有較強(qiáng)的殺滅作用，且不易產(chǎn)耐藥性和抗藥性，主要用于治療家禽球蟲(chóng)病。而近些年，有研究人員提出鹽霉素具有抵抗腫瘤的作用特性，且在殺傷乳腺癌干細(xì)胞方面比普通化療藥物作用顯著。鹽霉素可通過(guò)Wnt/β-catenin、ER、MAPK以

3、及Akt/NF-kB這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，并且這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與乳腺癌干細(xì)胞也有著密切的聯(lián)系。而近期關(guān)于Notch、Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究提示Notch、Hedgehog通路的異常激活與乳腺癌的產(chǎn)生有著重要的聯(lián)系。
　　本實(shí)驗(yàn)主要為乳腺癌的治療提供依據(jù)，重點(diǎn)說(shuō)明鹽霉素在殺傷乳腺癌干細(xì)胞的作用方面與Notch、Hedgehog通路的關(guān)系。
　　方法:培養(yǎng)人的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，并用不同濃度梯度

4、的鹽霉素處理后作用不同的時(shí)間。采用CCK-8檢測(cè)鹽霉素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以及作用48小時(shí)后IC50時(shí)的鹽霉素的濃度;采用克隆形成實(shí)驗(yàn)從克隆的形成能力方面觀察經(jīng)鹽霉素作用后乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖能力的變化;經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)觀察鹽霉素作用48小時(shí)后細(xì)胞周期的改變;采用流式細(xì)胞儀在程序性細(xì)胞死亡方面檢測(cè)鹽霉素處理48小時(shí)后細(xì)胞早期的凋亡的水平的變化:Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)是從侵襲和轉(zhuǎn)移的角度分析鹽霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的侵襲、

5、轉(zhuǎn)移能力的影響:進(jìn)一步通過(guò)觀察乳腺球成球能力上直觀分析和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD44+CD24-（乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物）比例的變化;并且用RT-PCR和Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證乳腺癌干細(xì)胞另一重要標(biāo)記物ALDH1的表達(dá)水平;RT-PCR和Western blot檢測(cè)經(jīng)鹽霉素處理后Notch/Hedgehog通路中靶基因Notch1、Hes1、SMO、Gli1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:1.CCK8檢測(cè)的結(jié)果顯示

6、:鹽霉素能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，且具有時(shí)間-劑量依賴(lài)性，低濃度的鹽霉素(＜0.5umol/L)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用較弱，當(dāng)濃度＞1umol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)，且48h的IC50為1umol/L?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:隨著鹽霉素濃度的增高細(xì)胞的克隆形成能力逐漸減弱。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期水平變化時(shí)發(fā)現(xiàn):鹽霉素能將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，而S期所占的細(xì)胞比例減少(0、0.5、1.0、1.5μmol/L的S期比例分別是45

7、.21％、33.23％、24.39％、11.85％)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平可以觀察到:0、0.5、1.0、1.5umol/L的鹽霉素處理后細(xì)胞早期凋亡水平分別是1.5％，5.65％，17.71％，20.41％。2.流式細(xì)胞儀從干細(xì)胞表型標(biāo)記的角度上檢測(cè)具有CD44+CD24-表型的細(xì)胞所占比例的結(jié)果顯示:經(jīng)0.5umol/L，1 umol/L，1.5umol/L鹽霉素處理后的比例分別是0.71％，0.32％，0.18％，顯著低

8、于對(duì)照組的1.2％。乳腺球成球試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著鹽霉素濃度逐漸增加，乳腺球的體積和數(shù)量也逐漸減小。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示:ALDH1的mRNA和蛋白水平隨著鹽霉素濃度的增加表達(dá)逐漸減少。
　　3.Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)從侵襲轉(zhuǎn)移層面上檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著鹽霉素濃度的逐漸增加，乳腺癌細(xì)胞在侵襲和轉(zhuǎn)移方面的能力逐漸減小。
　　4.采用Western blot和RT-PCR檢測(cè)ALDH1以及Notc