鹽霉素通過下調microRNA-221抑制乳腺癌干細胞增殖的機制研究.pdf

1、研究背景：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，是造成全球女性死亡的第二大腫瘤。腫瘤中一小部分具有自我更新和多向分化能力的細胞，在維持腫瘤生長、促進侵襲轉移以及放化療抵抗中起重要作用，被稱為腫瘤干細胞。腫瘤干細胞已經在白血病、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中被證實存在。CD44+/CD24-和乙醛脫氫酶1（ALDH1）等被用作乳腺癌干細胞篩選標記物。
　　鹽霉素是一種元羧酸聚醚類抗生素，最初被用于治療家禽類的球蟲病。近來

2、有研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素對乳腺癌干細胞的殺傷作用是乳腺癌最常用的化療藥物紫杉醇的100倍，但其選擇性殺傷乳腺癌干細胞的作用機制尚不清楚。有報道鹽霉素可通過靶向Hedgehog信號通路而抑制乳腺癌干細胞增殖。在骨肉瘤和胃癌中，鹽霉素可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而對干細胞起到細胞毒性作用。
　　microRNAs（miRNAs）是一種長度在19-25個核苷酸的單鏈非編碼小RNA分子，其通過堿基互補配對方式與靶基因mRNA3'U

3、TR區(qū)域結合，導致靶mRNA降解或抑制其翻譯，在增殖、分化和凋亡等生物學過程中發(fā)揮重要作用。miRNAs異常表達與乳腺癌干細胞增殖有關。其中 microRNA-221（miR-221）在乳腺癌細胞MCF-7形成的乳腺球中表達增高，MCF-7乳腺球細胞可在裸鼠產生更大的移植瘤，miR-221可能通過靶向調節(jié)ER-α和ATXN1等誘導乳腺癌細胞上皮-間質轉化（EMT）過程，或者通過抑制DNMT3b表達，增強乳腺癌細胞干性。此外，抑癌基因ph

4、osphatase and tensin homolog（PTEN）在胃癌和宮頸癌中被證明是miR-221的直接靶點，而PTEN失活可促進其下游的PI3K/Akt信號通路活性，在正常乳腺干細胞和乳腺癌干細胞中起重要調控作用。
　　目的：（1）探討miR-221促進乳腺癌干細胞增殖與PTEN/PI3K/Akt信號通路的關系；（2）探討鹽霉素選擇性殺傷乳腺癌細胞干細胞的作用與 miR-221及其調控的PTEN/PI3K/Akt信號通路

5、的關系。
　　方法：（1）以乳腺癌MCF-7細胞為實驗對象，利用lipofectamine2000轉染miR-221 mimic（miR-221）、miRNA無關序列（NC）和PTEN siRNA（siPTEN）。Taqman探針法qRT-PCR檢測miR-221表達水平。CCK-8和平板克隆實驗檢測miR-221上調或 PTEN敲低對乳腺癌細胞增殖能力的影響。乳腺球微球體培養(yǎng)實驗檢測miR-221上調或PTEN敲低對乳腺癌干細胞

6、增殖能力的影響。SYBR Green染料法qRT-PCR檢測PTEN mRNA水平，Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）和 COX-2，以及乳腺癌干細胞標記物 ALDH1表達。探討miR-221促進乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞增殖的機制。
　　（2）CCK-8實驗檢測鹽霉素在MCF-7細胞中的半數(shù)致死濃度（IC50）。乳腺球微球體培養(yǎng)實驗檢測鹽霉素對 miR-221上調的乳腺癌細

7、胞成球能力的影響，Taqman探針法qRT-PCR檢測鹽霉素作用后miR-221水平變化，SYBR Green染料法qRT-PCR檢測PTEN mRNA水平，Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）和COX-2，以及乳腺癌干細胞標記物ALDH1表達。體外實驗探討鹽霉素抑制乳腺癌干細胞增殖與miR-221及其調節(jié)的信號通路的關系。
　?。?）慢病毒表達載體LV-hsa-miR-22

8、1感染MCF-7細胞，裸鼠右側腹部皮下注射1?106個細胞。待腫瘤體積達到100mm3時，將裸鼠隨機分為兩組，一組鹽霉素4mg/kg腹腔注射，隔天一次，另一組注射等劑量DMSO。定期觀察并測量裸鼠體重和腫瘤大小。給藥7次后處死裸鼠，取出移植瘤組織。部分提取RNA，實時熒光qRT-PCR檢測miR-221和PTEN mRNA水平；部分提取蛋白質，Western blot檢測PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）和

9、COX-2，以及乳腺癌干細胞標記物ALDH1表達。體內實驗探討鹽霉素抑制乳腺癌干細胞增殖與miR-221及其調節(jié)的信號通路的關系。
　　結果：（1）實時熒光qRT-PCR和Western blot結果顯示miR-221組和siPTEN組PTEN mRNA和蛋白水平均顯著低于陰性對照Control組和NC組（P<0.05）。
　?。?）平板克隆實驗結果顯示，miR-221組細胞克隆數(shù)為730±40.4，與Control組（40

10、0±23.1）和NC組（454±50.3）相比，差異顯著（P<0.05），而與siPTEN組（870.8±78.2）相比則無顯著差異（P>0.05）。CCK-8結果顯示miR-221組和siPTEN組與Control和NC組相比，細胞增殖能力顯著增強。乳腺球培養(yǎng)實驗顯示miR-221組和siPTEN組形成的乳腺球體積明顯比Control組和NC組大，進而統(tǒng)計孔板內微球體數(shù)目，結果發(fā)現(xiàn) miR-221組形成281±17.5個乳腺球，siP

11、TEN組為306±12.3個，均顯著多于Control組（200±23.1）和NC組（181±23.5），P值均小于0.05。Western blot顯示miR-221轉染和PTEN敲低可使ALDH1蛋白表達明顯增多，PTEN下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）和COX-2表達也明顯增高。
　?。?）Taqman探針法qRT-PCR結果顯示鹽霉素能明顯降低MCF-7細胞內源性miR-221表達水平（P<0.05）；

12、藥物作用曲線結果表明鹽霉素半數(shù)致死濃度（IC50）為1μM，用于鹽霉素相關實驗。與miR-221組相比，鹽霉素處理組（Sal-miR-221）乳腺球體積明顯變小，數(shù)量明顯減少（117±9.4 vs180±15.6，P<0.05），ALDH1蛋白表達明顯降低。實時熒光 qRT-PCR結果顯示鹽霉素作用后 MCF-7細胞（Sal-miR-221組）中miR-221水平明顯降低（P<0.05），而PTEN mRNA水平顯著升高（P<0.05，

13、Western blot顯示PTEN蛋白表達也增高，PTEN下游因子p-Akt、p65和p-p65以及COX-2表達均增高。
　?。?）鹽霉素給藥組裸鼠皮下瘤體積明顯小于對照組，皮下瘤組織內 miR-221表達水平明顯低于對照組（P<0.05），PTEN mRNA表達水平明顯升高（P<0.05），PTEN蛋白增高，其下游因子p-Akt、NF-κB（p65、p-p65）以及COX-2表達均降低，干細胞標記物ALDH1表達亦明顯降低。

14、
　　結論：（1）在乳腺癌細胞中miR-221可在轉錄后水平抑制PTEN表達。
　　（2）miR-221促進乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞增殖，可能與 miR-221下調PTEN表達，導致其下游Akt磷酸化，激活NF-κB信號通路，促進COX-2表達有關。
　?。?）體內外實驗結果表明鹽霉素抑制乳腺癌干細胞增殖能力，可能通過降低miR-221水平，進而升高PTEN表達，使其下游因子Akt去磷酸化，抑制NF-κB活性和COX-