下調miR-221-222在人乳腺癌MCF-7細胞中的表達可抑制腫瘤細胞的增殖及遷移能力.pdf

1、目的:
　　為了探討microRNAs(miRNAs)在人類乳腺癌中的調控作用，本研究利用反義DNA技術敲低miR-221/222的表達從而調節(jié)其靶基因組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP3），以便研究其對人乳腺癌MCF-7細胞系的增殖和遷移能力的影響以及其分子生物學作用機制，為乳腺癌的進一步臨床治療研究提供一些新的基礎理論依據。
　　方法:
　　1.構建低表達miR-221/222的穩(wěn)定細胞株
　　依據miRBase

2、數據庫中hsa-miR-221、hsa-miR-222的寡核苷酸序列和一段無義序列，分別設計并重組成質粒AS-miR-221（antisense-miR-221即反義抑制miR-221）、AS-miR-222(antisense-miR-222即反義抑制miR-222)和Scramble（無義抑制），并將其分別使用脂質體（LipofectamineTM2000）轉染人乳腺癌MCF-7細胞，然后經過G418抗性篩選后建立穩(wěn)定表達的對照組（

3、Ctrl.、Scramble）細胞株、低表達miR-221和/或miR-222組(即AS-miR-221、AS-miR-222和AS-miR-221/222)細胞株。
　　轉染后于熒光顯微鏡下檢測轉染效率;逆轉錄PCR檢測各組穩(wěn)定表達細胞株中質粒載體上攜帶的抗性neo基因的表達情況，驗證轉染是否成功;Westernblot檢測各組穩(wěn)定表達細胞株中靶蛋白TIMP3的表達情況，驗證轉染是否整合。
　　2.在穩(wěn)定低表達細胞模型的基

4、礎上進行機制研究
　　進行逆轉錄PCR、Real-time PCR、Western blot等檢測轉染細胞株中miR-221、miR-222、TIMP3 mRNA和ADAM17的表達差異。
　　3.在穩(wěn)定低表達細胞模型的基礎上進行功能實驗
　　采用CCK-8實驗檢測并繪制生長曲線觀察低表達miR-221和miR-222組細胞的生長能力;劃痕修復實驗觀察轉染后細胞的遷移能力。
　　結果:
　　轉染24小時之后

5、，在熒光顯微鏡下觀察到各轉染組細胞的綠色熒光蛋白表達較多，即轉染效率較高;轉染后檢測各組細胞株中neo基因和靶蛋白TIMP3的表達:與對照組比較，neo基因和TIMP3蛋白表達明顯升高，即證實反義抑制的低表達穩(wěn)定細胞株構建成功。與Scramble組細胞表達情況相比較，各低表達miR-221/222(AS-miR-221、AS-miR-222、AS-miR-221/222)組細胞株中miR-221、miR-222的表達量降低，進一步說明質

6、粒構建成功且發(fā)揮了抑制miRNAs表達的功效;TIMP3 mRNA水平的表達是升高的，而其調控的金屬蛋白酶(ADAM17)的水平是降低的;生長曲線顯示各低表達miR-221/222組細胞的生長能力明顯受到抑制，劃痕結果顯示各低表達miR-221/222組細胞的遷移能力是降低的。
　　結論:
　　本研究成功構建了低表達miR-221/222的穩(wěn)定細胞株;并利用功能實驗證實，敲低miR-221/222后可以通過上調TIMP3表達