Pokemon對乳腺癌MCF-7細胞侵襲遷移能力的影響.pdf

1、目的：1.構建表達pokemon基因的慢病毒載體，建立穩(wěn)定性表達pokemon基因的乳腺癌MCF-7細胞系，并分別觀察pokemon的高表達對MCF-7細胞侵襲和遷移能力的影響。2.探討乳腺癌組織中pokemon蛋白的表達及意義。
　　方法：實驗分為兩部分：第一部分通過RT-PCT方法獲得pokemon-cDNA，將pokemon-cDNA與GV-165載體連接，得到帶有目的基因慢病毒表達載體，再將三種質(zhì)粒（GV165/Pokem

2、on、pHelper1.0、pHelper2.0）共轉染293T細胞，包裝得到病毒載體原液并測定其滴度。將得到的高滴度pokemon表達病毒載體（pokemon組）和空白病毒載體（NC組）分別轉染MCF-7細胞，建立穩(wěn)定高表達pokemon的乳腺癌MCF-7細胞系。通過熒光顯微鏡觀察Pokemon表達慢病毒載體的轉染效率，Western blot檢測GFP-Pokemon融合蛋白的表達能力，Transwell試驗及細胞劃痕實驗檢測pok

3、emon基因高表達對 MCF-7細胞侵襲遷移能力的作用。第二部分利用免疫組織化學方法（IHC）檢測185例乳腺癌及23例邊緣組織組合芯片中pokemon基因的表達情況，并且分析pokemon的高表達和乳腺癌的發(fā)病年齡、腫瘤組織類型、淋巴結轉移以及細胞核分級等臨床病理指標之間的相關性。
　　結果：第一部分：1.成功構建含有pokemon基因的慢病毒載體：1）通過RT-PCR方法獲得目的基因，將pokemon-cDNA和慢病毒載體表達

4、質(zhì)粒GV-165經(jīng)過酶切、連接、轉化后，得到GV165-pokemon重組載體，以上結果均經(jīng)過酶切及測序鑒定，與預期結果相符。2）將病毒載體三質(zhì)粒系統(tǒng)（Pokemon-GV165重組載體、pHelper1.0與 pHelper2.0）共轉染293T細胞48h后，離心后收集上清液，過濾器過濾后得到病毒濃縮液。3）將病毒稀釋后轉染293T細胞24h后，通過RT-PCR測定所收集的病毒滴度為2.0×108 TU/mL。2.成功建立穩(wěn)定高表達p

5、okemon的MCF-7細胞系:1）在pokemon表達病毒載體和空白病毒載體(NC)轉染MCF-7細胞48小時后，在熒光顯微鏡下兩組細胞均可見GFP蛋白表達（綠色熒光）。2）pokemon轉染組GFP及融合蛋白的表達主要集中于細胞核，而空白病毒轉染組其表達主要分布于細胞質(zhì)。3）Western blot顯示在pokemon轉染組中6號克隆具有pokemon-GFP融合蛋白的表達，而空白病毒轉染組只有GFP蛋白表達。3.Transwell

6、實驗結果顯示pokemon組比NC組到達Transwell小室下室的細胞數(shù)目明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明pokemon可抑制MCF-7細胞的侵襲能力。4.劃痕實驗結果提示pokemon組比NC組經(jīng)過8h、32h后細胞遷移的距離無明顯變化，表明pokemon基因對MCF-7細胞遷移能力無明顯影響。第二部分：1.pokemon蛋白在乳腺癌中的表達高于癌旁正常乳腺組織（P<0.05）。2.pokemon蛋白高表達和乳腺癌